Zeolita natural clinoptilolita: nuevo adyuvante en la terapia contra el cáncer

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Resumen 

Materiales de silicato naturales, incluyendo la clinoptilolita zeolita, se ha demostrado que exhiben diversas actividades Cal biológicamente y se han utilizado con éxito como un adyuvante de cine VCA y para el tratamiento de la diarrea. Presentamos un nuevo uso de la clinoptilolita finamente molido como un adyuvante potencial en la terapia contra el cáncer. tratamiento clinoptilolita de ratones y perros que sufren de una variedad de tipos de tumores condujo a una mejoría en el estado de salud general, la prolongación del tiempo de vida, y disminución en el tamaño de tumores. aplicación local de clinoptilolita para cánceres de la piel de los perros reduce eficazmente la formación de tumores y el crecimiento. Además, estudios toxicología en ratones y ratas demostrado que el tratamiento no tiene efectos negativos. En el tejido vitro estudios de cultivo mostraron que clinoptilolita molida finamente inhibe la proteína quinasa B (c-Akt), induce la expresión de p21 WAF1 / CIP1 y p27 Kip1 proteínas supresoras tumorales, y bloquea el crecimiento celular en varias líneas celulares de cáncer. Estos datos indican que el tratamiento clinoptilolita podría afectar el crecimiento del cáncer mediante la atenuación de las señales d supervivencia y la inducción de genes supresores de tu- mor en las células tratadas.

Introducción

Las zeolitas se hidratan cristales microporosas naturales y sintéticas con estructuras bien definidas que contiene AlO 4 y SiO 4 tetraedros unido a través de los átomos de oxígeno comunes [1]. Las zeolitas se han utilizado ampliamente en diversas aplicaciones industriales basados en sus propiedades para actuar como catalizadores, intercambiadores iónicos, adsorbentes, y mejoradores de la detergencia [2, 3, 4, 5, 6]. También se sabe que los silicatos y aluminosilicatos poseen actividad biológica, ya sea extremo positivo o negativo. El talco y sílice se han utilizado en cuidado de la piel durante muchas décadas, mientras que las estructuras bien definidas y actividad catalítica hacen aluminosilicatos un sistema de modelo atractivo para proteínas y enzimas miméticos [7]. ciento resulta re- también han demostrado que natural, biológicamente clinoptilolita no tóxica de los depósitos de Cuba es muy eficaz como adsorbente glucosa, y esto ha sido sugerí como un medicamento potencial para las personas que sufren de diabetes mellitus [8]. 

La actividad biológica positiva más conocido de clinoptilolita natural es su acción como fármaco antidiarreico (ver [9] y las referencias en él). Clinoptilolita reduce la incidencia de muerte y la enfermedad (síndrome diarreico) producido por enfermedades intestinales en cerdos, ratas, y terneros (ver [9] y las referencias en él). Basándose en estos resultados un amplio estudio se llevó a cabo en medicamentos antidiarreicos basado en clinoptilolita natural como al materializarse activo, en la terapia de las enfermedades diarreicas agudas en humanos [9]. La investigación condujo a la aprobación del fármaco antidiarreico Enterex para su uso en seres humanos. Además,  la acumulación de evidencia ha indicado que las zeolitas tienen un papel importante en la regulación del sistema inmune. Ueki et al. [10] y Aikoh et al. [11] han informado de que la sílice, silicatos, y aluminosilicatos actúan como estimuladores inmunológicos no específicos de manera similar a los superantígenos. Los superantígenos son una clase de proteínas inmunoestimuladores y causantes de enfermedades de origen bacteriano y viral con la capacidad de activar fracciones relativamente grandes (5 – 20%) de la población de células T. La activación requiere la interacción simultánea de los superantígenos con el dominio Vβ del receptor de linfocitos T y con las principales moléculas de histocompatibilidad de clase II complejas en la superficie de las células presentadoras de antígeno [10]. Los macrófagos proinflamatorios, que pertenecen a las células que presentan antígeno de la clase II MHC, son activados por partículas fibrogénicas de silicato [12, 13, 14, 15]. De hecho, los experimentos llevados a cabo por Ueki y sus compañeros de trabajo [10] han demostrado que la eliminación de las células positivas DP/DR de la clase II del MHC da lugar a una falta de estimulación de los macrófagos por el amianto. 

La interacción directa de partículas de silicato con células que no sean linfocitos también se ha identificado y descrito. Parece que las partículas minerales pueden desencadenar alteraciones en la expresión génica mediante el inicio de los eventos de señalización aguas arriba del gen de la transactivación [16]. La exposición de las células a partículas de silicato se ha demostrado que conducen a la activación de quinasas activadas mito--gen de proteína (MAPK), proteína quinasa C, y las proteínas quinasas activadas por estrés [17]. También se activan factores de transcripción importantes como la proteína activadora 1 y el factor nuclear κB, y la expresión de citoquinas proinflamatorias como la interleucina 1α, la interleucina 6 y el factor de necrosis tumoral α se ha mejorado [18]. Las modificaciones en la cinética de activación del receptor o la actividad de las integrinas pueden ser responsables del comportamiento observado. Alternativamente, se han notificado partículas engulliadas por fagocitosis para estimular la producción de especies reactivas de oxígeno [19]. Recientemente se demostró que la regulación redox de la expresión génica es un fenómeno general en la mayoría de las células. 

El conocimiento por encima de las zeolitas y otros silicatos nos llevó a probar la actividad biológica de clinoptilolita natural. Se utilizó el tratamiento mecánico de clinoptilolita natural para producir partículas de tamaño pequeño (MZ) que se probaron para su posible actividad toxicidad y contra el cáncer en vivo. Aquí nos proporcionan evidencia de que la clinoptilolita natural, administrada por vía oral no es tóxico y útil en el tratamiento del cáncer en modelos animales. Adicional en los experimentos de cultivo de tejidos in vitro con diversas líneas celulares de cáncer indicado que el tratamiento MZ modifica vías de señalización intracelulares que conducen a la inhibición de las señales de supervivencia e inducción  de genes supresores de tumor.

Materiales y métodos

Clinoptilolita natural

El polvo fino de clinoptilolita natural, fue obtenido  por micronización tribomecanica. La composición química de la MZ se determina por la espectroscopia de absorción atómica. análisis de fase cualitativa y cuantitativa de la MZ se realizaron por polvo de difractometría de rayos X utilizando un difractómetro Siemens 5000D con CuK α radiación en la región 2 θ = 4-80 °. Termogravimétrico y análisis termogravimétrico diferencial de la MZ se llevó a cabo utilizando un Sistema de TA 4000 aparato (Mettler-Toledo). La velocidad de calentamiento fue de 10 K / min en atmósfera de nitrógeno. Tamaño de las partículas curvas de distribución de la MZ fueron tomadas por un analizador de tamaño de partícula de dispersión de luz Mastersize XLB (Malvern) láser.

Líneas celulares y ensayo de proliferación

Efecto de MZ sobre la proliferación celular in vitro Se estudió en varias líneas celulares humanas: fibroblastos diploides (Hef522), carcinoma cervical (HeLa), carcinomas de colon (Caco-2, HT-29, y SW 620), carcinomas mary mamiferos (MCF -7 y fibrosarcoratón línea celular ma SKBR-3), y uno. Las células se mantuvieron mediante cultivo en medio de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2 mM L- glutamina, 100 U / ml de penicilina, y 100 g / ml de estreptomicina en una atmósfera humidificada con 5% de CO 2 a 37 ° C. Para el propósito de los experimentos ensayo de proliferación de las células se sembraron a una concentración de 1 × 10 4 células / ml sobre placas de 96 micropocillos (200 l / pocillo). Después de la incubación durante la noche el medio estándar se reemplazó con el medio que se trató previamente con cualquiera de 0,5, 5, o 50 mg / ml MZ. Para este propósito el medio y MZ se mezclaron, y después de 18 h de agitación MZ se sedimentó por centrifugación (5.000 sol durante 10 min).

Las células se incubaron entonces durante 72 h adicionales, cuando la viabilidad celular (crecimiento celular) se midió usando el ensayo MTT que detecta actividad deshidrogenasa en células viables. Para este propósito se desechó el medio y se añadió MTT a cada pocillo a concentrado de 20 g / 40 l. Después de 4 h de incubación a 37 ° C los precipitados se disolvieron en 160 l de DMSO. La absorbancia se midió en un lector de ensayo de inmunoadsorción ligado a enzima a 570 nm. La proliferación celular se expresa como un porcentaje de la absorbancia, registrado en la línea celular tratada con especial concentración de MZ, en relación con la absorbancia de control, no tratadas, células que se expresó como 100%.

Análisis de p21 WAF1 / CIP1 y p27 Kip1

Los experimentos con p21 WAF1 / CIP1 y p27 Kip1 se llevaron a cabo en adenocarcinoma humano (Caco-2) y las líneas celulares de carcinoma cervical (HeLa) humanos. Las células, cultivadas originalmente en matraces de cultivo tisular, se recogieron y se sembraron en portaobjetos de vidrio. Después de 24 h el medio fue reemplazado o bien con los (células TROL con-) medio estándar fresco o con el medio pretratado con 50 mg / ml MZ. Después de 72 h de incubación se lavaron las células con PBS y se fijaron en metanol con 3% de peróxido de hidrógeno (Kemika, Zagreb, Croacia).

Proteínas, p21 WAF1 / CIP1 y p27 Kip1, Se analizó la expresión inmunocitoquímicamente. La unión no específica fue bloqueada por AP- suero surcando normal de conejo (1:10) durante 30 min. p21 anticuerpos primarios (5 g / ml, PharMingen) y p27 (2 g / ml, labo- Transducción labo-) se deja que se una durante la noche a 4 ° C. Los portaobjetos se lavaron tres veces en PBS. El anticuerpo secundario (de conejo anti-ratón; Dako, Dinamarca) se aplicó durante 1 h a temperatura ambiente. Por último, la peroxidasa-antiperoxidasa (Dako) conjugado diluido 1: 100 en PBS, se aplicó durante 1 h a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS los portaobjetos se tiñeron con 0,025% tetraclorhidrato de diaminobencidina (Sigma) que contiene 4% de H 2 O 2 durante 7 min y se contramancha con hematoxilina durante 30 s. Las diapositivas fueron analizadas con un microscopio óptico (Olympus). El nivel de tinción de fondo no específica se estableció para cada medición utilizando células de control procesados de la misma manera, pero sin la exposición al anticuerpo primario.

La concentración de antígeno se evaluó mediante la estimación de la intensidad visual relativa de una etiqueta cromógena, y los resultados se expresan en una escala de tres puntos de la siguiente manera: -, tinción negativa;+, tinción débil y ++, tinción moderada.

Los estudios bioquímicos de las vías de señalización

se utilizaron los siguientes: factor de crecimiento epidérmico (EGF; InterGen), factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) BB (Amgen), marcadores de escalera de proteína (10 – 200 kDa; Life Technologies), leupeptina y un kit inhibidor de la miniproteasa (Boehringer-Mannheim), Pefabloc (Fluka), aprotinina (Trasylol, Bayer) y membranas de nitrocelulosa (Milipore). Los anticuerpos policlonales anti-Akt, antipAkt, anti-JNK, anti-pJNK y anti-pERK2 (MAPK) de conejo purificados por afinidad se compraron en BioLabs de Nueva Inglaterra. Los anticuerpos policlonales anti-Erk2 (C-14) de conejo eran de Santa Cruz Biotechnology. Los anticuerpos secundarios, anticonejo conjugados con peróxido, eran de BioLabs de Nueva Inglaterra, inmunoglobulina antiratones de oveja conjugada con peróxido de Amersham/Pharmacia y proteína de peróxido conjugada a de los laboratorios Kirkegaard y Perry. Las células de fibrosarcoma murino se cultivaron en placas Petri (6 cm de diámetro) en Medio RPMI con 10% de FBS hasta la confluencia del 80%. Antes de comenzar los experimentos las células estaban hambrientas durante 24 h. Posteriormente, las células fueron tratadas con un medio pretratado MZ con o sin 10% de FBS para 0,5, 30 y 60 min o con EGF (100 μg/ml) y PDGF (40 μg/ml). Después de la hora indicada de tratamiento las células fueron lavadas con PBS y raspado en IceCold lisis buffer que contiene 50 mm hidroxietilpiperazina ácido sulfónico de etano, pH 7,2, 150 mm NaCl, 1 mm EDTA, 20 mm NAF, 2 mm orovanadato sódico, 1% (p/v) Triton X-100, 10% (p/v ) glicerol y inhibidores de la proteasa (1 mM de Pefabloc, 10 μg/ml de leupeptina y 1% de Trasylol). Después de 45 min a 4 ° c con balanceo suave una fracción soluble fue preparada por centrifugación a 4 ° c durante 15 min a 13.000 g. cantidades iguales de Lisados celulares (medido por el ensayo Bradford) fueron mezclados con 3 × sodio dodecil sulfato (SDS) tampón de muestra y calentado durante 2 min en 98 ° c. Las proteínas fueron separadas por electroforesis de gel de poliacrilamida SDS y transferidas a la membrana de nitrocelulosa. Los inmunoblots fueron bloqueados con 5% de albúmina sérica bovina en TBS (Tris-HCl de 10 mM, pH 7,4; 150 mM NaCl) para 1 h, incubado durante 1 h con anticuerpos primarios (anti-pAkt, anti-pJNK, anti-pERK2) en TBS, lavados seis veces por 10 min cada uno en TBS 0,05% Triton X-100, y luego incubados para 1 h con el anticuerpo secundario apropiado. Después de otros lavados, se visualizaron inmunoblots mediante el uso de reactivos de quimiluminiscencia mejorados. Para sondear los blots fueron incubados en tampón de desforrado (Tris-HCl 62,5 mm, pH 6,7; 2% SDS; 100 mm 2-Mercaptoetanol) a 58 ° c durante 25 min, lavados extensivamente con TBS, rebloqueados como se describió anteriormente, y rebloqueado con el anticorporal apropiado.

Aislamiento de fragmentos de ADN de apoptosis células HeLa (1 × 10 5) se hicieron crecer en un matraz de 10 ml durante 24 h, después de lo cual el medio se desecha y se reemplaza con el MZ pre- medio tratado (ver arriba). Después de 24 h se tripsinizan las células, se sedimentaron por centrifugación (1200 sol), y se lavó dos veces en PBS. Después las células se resuspendieron 10 s en 100 l de tampón de lisis (1% NP-40 en EDTA 20 mM, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5) y centrifugado 5 min a 3000 sol.

El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo Eppendorf, mientras que el sedimento se incubó una vez más con tampón de lisis 100 l y se centrifugó como antes. Los sobrenadantes se agruparon y se incubaron 2 h en 1% de SDS y RNasa (5 g /? L) a 56 ° C, después de lo cual la proteinasa K se añadió en una concentración final de 2,5 g / l durante la noche. Los fragmentos de ADN se sedimentaron mediante la adición de medio volumen de acetato de amonio 10 M y 2,5 volúmenes de etanol absoluto previamente enfriado. Después de la centrifugación (30 min, 12000 sol), el sedimento se lavó con etanol al 70%, se centrifuga 10 min a 12000 sol, se secó, y se disolvió en 20 l de tampón TE (Tris-HCl 10 mM pH 7,4; EDTA 1 mM pH 8). El ADN se visualizó en 1,5% de gel de agarosa.

Animales

Ratones

Se han usado CBA / HZgr y C57BL / 6 ratones de ambos sexos. experimentos estudio de toxicidad se realizaron en la cepa CBA / HZgr, mientras que los experimentos con tumores se realizaron en ambas cepas. Para la tolerancia no clínico que prueba ratones macho de la cepa BALB / c fueron utilizados. Al inicio de los experimentos los animales fueron alrededor de 4 meses de edad, con un peso 25-28 g. Hasta comenzar los experimentos, los ratones se mantuvieron en condiciones estándar con acceso libre a alimento y agua.

Las ratas

Ratas Wistar de ambos sexos de la colonia de cría de animales en el Instituto para la Investigación Médica, Zagreb, Croacia se utilizaron para toxicidad y estudios no clínicos de tolerancia de prueba. Al comienzo de los experimentos que eran 2-3 meses de edad, con un peso promedio de 300 g (machos) y 200 g (hembras).

Perros

Veintidós perros fueron utilizados en los experimentos. Eran de razas diversos, con un peso de 3 a 42 kg. Los animales eran de ambos sexos, de 5-14 años de edad. Los datos de los 14 perros en los que se observó mejora de la enfermedad se presentan en la Tabla 2.

Aplicación de clinoptilolita natural tratado mecánicamente (MZ)

Debido a la insolubilidad de la sustancia ensayada, que se administró a los animales por vía oral por sonda o en su dieta (ratones, ratas), suplementado en forma de polvo a la comida convencional, o en capsulas (perros) que se mezclaron de nuevo a la alimentación. Cuando se prueba el crecimiento de carcinoma mamario aplásica o mamaria aplásica formación metástasis de carcinoma de MZ y comida estándar para ratones de laboratorio (Pliva, Zagreb, Croacia) se mezclaron en la relación de 20%: 80%. Cada ratón en promedio comió aproximadamente 4 g de cada día, consumiendo así aproximadamente 800 mg MZ. Cuando se prueba el crecimiento de melanoma, MZ se les dio a los ratones por vía oral (sonda) en dosis de 20, 30, y 40 mg / ratones cinco veces por día (dosis ensayadas eran 100, 150, y 200 mg / ratones, respectivamente). En estudios de toxicidad MZ se aplicó en la dieta mezclada con comida estándar.

Tumores

carcinoma mamario se produjo espontáneamente en ratones CBA / HZgr, mantenida en la sección de cría de animales de la División de Molecular Medicina, Ruder Boškovic Instituto, Zagreb, Croacia. El tumor es un carcinoma anaplásico altamente con incidencia muy alta de mitosis; no se forma ningunas estructuras glandulares y conduce a las metástasis espontáneas en los pulmones. Después del trasplante de 1 × 10 6 células tumorales viables en los animales un tumor en crecimiento se obtiene que causa la muerte del ratón después de aproximadamente 4 semanas. A los efectos de la suspensión celular experimentos tumor siempre fue preparado a partir de tumor de crecimiento in vivo.

El melanoma B16, obtenido originalmente de Holt Radium Institute, Manchester, Reino Unido, se ha mantenido en el Ruder Boškovic Instituto' desde 1975 por inoculaciones subcutáneas de suspensión que contiene 2 × 10 6 las células tumorales en los flancos de ratones C57BL / 6. tumores espontáneos en perros eran de diversos orígenes, tamaños y ubicaciones. Los datos de 14 tumores se presentan en la Tabla 2. En otros 8 tumores, que no se presentan en la Tabla 2, había dos más linfocitos, dos anemias hemolíticas autoinmunes, y uno de cada uno de tumor tate pros-, osteosarcoma, fibrochondroadenocarcinoma, and epulis.

Para obtener células tumorales en suspensión grandes piezas de tumor que se habían quitado de los ratones se cortaron en trozos muy pequeños (Lution SO- de Hank). Las partículas se dejaron sedimentar, y se eliminó el sobrenadante (suspensión celular) y centrifugaron a 150 sol durante 10 min. El sedimento se resuspendió y la viabilidad celular se ensayó por Trypan prueba de exclusión con azul: más del 90% de las células tumorales se anotó como viable. Para obtener localmente crecimiento tumoral, un inóculo de 0,1 ml, que contienen 1 × 10 6 células tumorales viables, se inyectaron por vía subcutánea en el muslo derecho de ratones receptores. El crecimiento del tumor se comprobó cada día después de la inoculación de células tumorales en los ratones. Cuando se estableció el tumor, su tamaño se midió por un calibrador. Se midieron tres diámetros, y el volumen del tumor fue calculado. Para obtener pulmonar experimental metástasis 0,25 ml, que contiene 1 × 10 5 células de carcinoma plástica mamarias, se inyectaron en la vena de la cola del ratón. Los ratones se sacrificaron 18 días después. Los pulmones fueron movidos re-, se lavaron en agua, se separó en lóbulos, y se sumergieron en un fijador. Se contaron los nódulos visibles macroscópicamente en la superficie del pulmón.

Los estudios toxicológicos

Toxicológico preclínico se realizó de acuerdo a las normas y reglamentos de la Organización de Cooperación Económica y Desarrollo principios de la práctica de laboratorio de alimentos (París 1998). La prueba fue abordada mediante el establecimiento de la prueba de “límite” - la aplicación de las altas dosis de MZ, 2 × 200 y 2 × 500 mg / ratón por día por vía oral (sonda nasogástrica) durante 6, 14, y 30 días. Dado que el MZ no causó la muerte de los ratones en un ensayo de “límite”, un “arriba y abajo” test se realizó en ratones, con dosis diarias que van de 60 a 400 mg / ratón (MZ administra por vía oral, alimentación por sonda, durante 30 días). Una vez más, no se observó toxicidad. Por lo tanto una aguda clásica, estudio de toxicidad subcrónica y crónica de ratones y ratas de ambos sexos (por separado) se realizó.

Ratones

Los ratones eran de la cepa CBA / HZgr. MZ fue dado en una dieta (en polvo MZ mezclado con el alimento estándar en la proporción de 25: 75%). La duración del estudio fue la siguiente: toxicidad aguda, 1 mes; toxicidad crónica sub-, hasta 3 meses; toxicidad crónica, hasta 6 meses. Los animales fueron controlados para: cambios fenotípicos, los cambios en comporta- miento, y la supervivencia (cada día), cambios en el peso corporal (ly de semana), cantidad de comida y agua consumida (comprobado en los días 14 y 28 cuando los ratones se mantuvieron durante 24 h en jaulas metabólicas, cinco ratones por jaula), los cambios en hematológicos y parámetros química clínicas de suero (eritrocitos, leucocitos, plateletes, hematocrito, globina hemo-, glucosa, fosfatasa alcalina, aspartato aminotransferasa, alanina aminotransferasa, bilirrubina, fósforo inorgánico, y calcio; después de 1, 3, y 6 meses); y los parámetros de la química clínica de la orina (glucosa, proteínas, urobilinógeno, bilirrubina, nitritos, eritrocitos, leucocitos, pH, y la gravedad específica; se recogió la orina mientras los animales se mantuvieron, una vez al mes durante 24 h, en jaulas metabólicas) análisis histopatológico de hígado, bazo, riñón, cerebro, pulmón, testículos, ovario, duodeno, ojo, estómago, intestino grueso y delgado, músculos, miocardio, páncreas, timo y ganglios linfáticos axilares se llevó a cabo en ratones experimentales y de control muertos.

Las ratas

Se utilizaron ratas Wistar. MZ fue dado en una dieta (mezclado con comida estándar en proporciones de 25:75 y 50:50). La duración del estudio fue la siguiente: toxicidad aguda, 1 mes; toxicidad subcrónica, 3 meses; toxicidad crónica, 12 meses. Los animales fueron controlados para: cambios fenotipos, cambios en el comportamiento y la supervivencia (cada día), cambios en el peso corporal (cada 4 días), cantidad de alimentos (cada día) y agua consumida (cada 4 días), y los cambios en hematológicas y suero parámetros de química clínica (el mismo que para los ratones, una vez al mes). análisis histopatológico de hígado, bazo, pulmón, kindey, testículos, ovario y cerebro, se realizó en Perimental y control ratas ex muertos después de 1, 6, y 12 meses.

La toxicidad reproductiva / de desarrollo fue probado en ratones (CBA / HZgr) debido a su corto período de gestación y el tamaño de camada más grande. MZ fue dado en una dieta (en polvo MZ mezclado con el alimento estándar en la proporción de 25: 75%). Para estudio de toxicidad reproductiva diez hombres y diez ratones hembra fueron alimentados con la comida suplementada con el MZ para 50 y al menos 14 días, respectivamente, antes de conocerlo. El tratamiento continuó durante el antes del embarazo y el período de embarazo (un ciclo) y al punto de destete descendencia. El mismo par de animales se alimentó con el MZ y monitoreado duran cuatro ciclos consecutivos (aproximadamente 4-5 meses). El mismo horario se aplicó por el control, no tratados, animales. La generación parental controló por la duración del período del ciclo (antes del embarazo y el período de embarazo), la fertilidad (presencia o ausencia de basura ciclo particular), la incidencia de parto, la mortalidad y el aspecto histopatológico de los ovarios, después de 4º ciclo. Número de cachorros nacidos totales y viables como la ganancia de peso bien en cachorros cuerpo y la mortalidad crías hasta el destete era también anotó.

Para estudio de teratología sana, ratonas embarazadas no tratadas se alimentaron con MZ mixta a la comida convencional desde el día 6 hasta el día 16 de la gestación y los ratones fueron sacrificados 1 día antes del parto. Los fetos se analizaron para la patología microscópica.

La tolerancia local se evaluó para determinar si la sustancia de ensayo es tolerada en los sitios en el cuerpo que pueden entrar en contacto con el producto como resultado de su administración. -Dosis repetidas pruebas de tolerancia dérmica se realizó en ratas Wistar macho y ratones BALB / c macho. MZ se aplicó sobre la piel afeitada de toda la región dorsal de los animales de tres maneras: (a) en forma de polvo original, (b) mezclado con la nata neutral en la proporción de 1: 1, (c) mezclado con aceite de parafina en la proporción de 1: 1. Los animales se trataron dos veces al día durante 28 días. cambios macroscópicos en la piel tratada se examinaron diariamente. La región dorsal izquierda del animal se utilizó como control. Para el análisis microscópico de los cambios posible se recogieron las muestras de piel 1 día después del último tratamiento.

Resultados

Propiedades de la clinoptilolita natural tratado mecánicamente clinoptilolita tratada mecánicamente naturales (MZ) contenida aproximadamente 85 en peso% clinoptilolita. El restante ing 15% consistió en sílice, montmorillonita y zeolita principalmente mordenita. La composición química de la clinoptilolita natural se presenta en la Tabla 1. Análisis térmico diferencial (diferencial termogravimétrico) del MZ muestra que la tasa máxima de desorción de agua se produjo a 50 ° C, lo que indica que el cambio de peso de la muestra durante el calentamiento a 50 ° C corresponde a la al obligan a quitarse de humedad suelto y sujeto dentro de la microestructura sólida. Análisis de la curva de desorción de agua muestra que el MZ contiene aprox. 16 wt % De agua (que se mantienen sueltos humedad + agua zeolítico) de los cuales aprox. 2 en peso % Es ligeramente la humedad retenida (Fig. 1A, B). No fase transformación se observó durante el calentamiento de MZ a 800 ° C. El análisis del tamaño de partícula de la MZ mostró que la frecuencia máxima de las partículas (aprox. 13%) apareció en 1,5 micras con un tamaño medio de 2,9 micras. En el 25% de partículas del tamaño era de hasta 1,5 m, en el 50% hasta 2 m, y en 75% hasta 3 m (Fig. 1C, D).

El efecto de MZ sobre la proliferación de líneas celulares cultivadas in vitro

La Figura 2 presenta el estado de proliferación celular de las células de fibrosarcoma de ratón Hef522, HeLa, células Caco-2, SW620, HT-29, MCF-7, SKBR-3, y después de 3 días de tratamiento. El crecimiento de todas las líneas celulares excepto Hef522 y SW620 se inhibió significativamente con la dosis de 50 mg / ml. La inhibición más fuerte (el 50%) se observó en el ratón fibrocélulas de sarcoma, el crecimiento de células SW620 se inhibió significativamente con la dosis de 50 mg/ml. La inhibición más fuerte (para 50%) se observó en las células de fibrosarcoma del ratón, el crecimiento de SW620 células no se modificó, y la de Hef522 células fue ligeramente estimulada. Se observaron resultados similares midiendo el ensayo de incorporación de timidina [3H] en presencia de 10% de FBS en células de fibrosarcoma de ratón (datos no mostrados).

Análisis de vías de señalización intracelular en las células tratadas-MZ

Dado que los estudios anteriores han indicado que la exposición de las células a partículas de silicato conduce a la activación de MAPK, la proteína quinasa C, y proteína activada por estrés Kinases/JNK [17], analizamos además si el tratamiento MZ también afecta a las vías de señalización miogénicas y de supervivencia en estos modelos celulares. 

Los resultados más significativos se detectaron midiendo la actividad de la proteína Akt. Akt, o la proteína quinasa B, se ha demostrado recientemente para mediar señales de supervivencia Down- corriente de fosfoinosítido 3 quinasa por fosforilación de proteínas malo. Hemos observado un aumento de la fosforilación de Akt en respuesta al suero, EGF, insulina o trata- miento. La adición de la MZ pretratado medio que contiene 10% de FBS a las células disminuyó fosforilación Akt en comparación con las células tratadas sólo con medio que contiene suero, mientras que la adición de factores de crecimiento EGF y PDGF restaurado su actividad (Fig. 3A) y exceso de la llegada de los efectos de MZ sobre el crecimiento celular. Determinación de la actividad de Akt en diversos momentos después de la adición de MZ pretratado medio con FBS al 10% mostró ligero pliegue de- en nivel Akt después de 5 min. Esta disminución fue más pronunciada después de 30 y 60 min de tratamiento (Fig. 3B). Sin embargo, la adición de MZ pretratado medio sin suero a las células aumento de la actividad de Akt en comparación solo a las células privadas de suero. tratamiento durante la noche de las células con EGF también aumentó la actividad de Akt.

El efecto de MZ en la expresión de inhibidores de Cy Cline dependientes de quinasas, p21 WAF1CIP1 y p27 Kip1, se ensayó utilizando el método inmunocitoquímico, en HeLa y células Caco-2. El tratamiento con MZ indujo la expresión de p21 WAF1 / CIP1 en 2-CaCo células y p27 Kip1 en células HeLa, mientras que las células no tratadas fueron negativas para la expresión de p21 WAF1 / CIP1 / p27 Kip1 ( Fig. 4).

La inducción de la muerte celular programada

Para evaluar si la inhibición del crecimiento celular por MZ es debido a la muerte celular programada, es decir, la apoptosis, se hizo un tiente franco para aislar fragmentos de ADN pequeños. Gran cantidad de pequeños (degradado) fragmentos de ADN en el ADN aislado indicaría que MZ induce la muerte celular programada en las células tratadas. El resultado de pequeña aislamiento fragmento de ADN a partir de células HeLa se muestra en la Fig. 5. Tratado ADN aislado partir de células MZ tratadas mostraron significativa la degradación de los (carril 3a mayor de ADN de bajo peso molecular, degradada indicado con una flecha) en comparación al ADN a partir de células no tratado (carril 2). La degradación del ADN en las células MZ tratado es muy probablemente debido a la muerte celular programada inducida (apoptosis).

Toxicología

Oral (en la dieta) la administración de MZ a ratones y ratas para 6 y 12 meses, respectivamente, no causó cambios que podrían ser considerados un efecto tóxico del tratamiento. el MZ ecualizada (regulada) y se acorta el período antes del embarazo. El número de crías por camada se incrementó en los ratones tratados con MZ. Probablemente por esta razón se redujo la ganancia de peso corporal crías hasta el destete. Como final consecuencia una mayor mortalidad de las crías entre los días 8 y 21 del periodo neonatal se observó. Sin embargo, no hay diferencias entre el control y anima- les tratados que sugeriría toxicidad reproductiva atribuible a la administración MZ. El MZ no provocó toxicidad durante el período de organogénesis. postura La prueba sub-, MZ, no era tóxico o alergénico para la piel.

Efecto de MZ sobre el crecimiento tumoral en modelos animales

Estudios previos en células cultivadas han sugerido que MZ inhibe el crecimiento de células cancerosas in vitro. Para estudiar el efecto de MZ en estudios in vivo en ratones, ratas y perros se realizaron. Se realizaron estudios posteriores sobre tumores murinos trasplantables, B16 melanoma y carcinoma mamario. Se inyectaron células de carcinoma de aplásica mamarias en el muslo derecho de dos grupos de ratones. Un grupo (n = 14) se alimentó con comida suplementada con MZ a partir de 15 días del trasplante del tumor antes hasta la muerte del animal; el otro grupo ( n = 14) se alimentó con MZ desde el día del trasplante del tumor hasta la muerte del animal. Un grupo de cinco ratones portadores de tumores recepción comida estándar se utilizó como control. El crecimiento del tumor se inhibió de manera significativa en ambos grupos de animales alimentados con MZ suplementado alimentos (Fig. 6). Las curvas de crecimiento del tumor para los animales individuales eran uniformes, en particular cuando MZ se le dio antes del trasplante de tumor. Sin embargo, no hubo diferencia en los ratones supervivencia entre los grupos. células de melanoma B16 se inocularon subcutáneamente en ratones C57BL en el día 0. Durante los siguientes 30 días se les dio a los ratones por vía oral MZ cinco veces por día. El volumen del tumor se registró; era marcadamente inferior en 5 de 80 ratones (dosis diaria de 150 mg / ratón) que en el grupo de control.

(Fig. 7A). A pesar de que los tumores comenzaron a crecer más rápidamente después de la terapia con MZ estaba cerrado abro- (entre los días 30 y 60 después de tumor trasplantación), los ratones vivieron un periodo estadísticamente significativamente más largo cuando son tratados con 200 y 150 mg MZ de TROL animales con- (Fig. 7B). Los ratones usados para experimental de pulmón carcinoma mamario aplásica formación de metástasis se alimentaron con dieta MZ desde 15 días antes de la inyección de las células tumorales hasta el final del experimento, es decir, 18 días después del trasplante del tumor. Los controles consumen alimentos Normalizados. Cada uno de estos dos grupos compuestos 20 anima- les. Aproximadamente 20-40 nódulos por animal se puntuaron, pero no hubo diferencia entre los grupos (datos no presentados).

No hubo efecto del tratamiento con MZ en el crecimiento in vivo de dos carcinomas mamarios que diferían de que mostraron en la Fig. 6 (datos no mostrados).

De los 22 perros que sufren de varios tipos de tumores espontáneos fueron tratados con MZ, 14 respondieron a la terapia, es decir, el tumor desapareció completamente, o el tamaño del tumor se redujo significativamente (presentada en la Tabla 2). Entre tres perros que tenían tumor de próstata había uno que fue indicada ecografía mostró tener (además de tumor de próstata) un quiste de próstata (caso 3). El perro estaba visiblemente tranquilo, sin AP- pequeña, y apenas se movía. Cuando el tratamiento habitual no funcionaba, se inició la terapia MZ. Después de sólo 2 días de tratamiento, el perro se convirtió en activo; en el tercer día empezó a comer normalmente, y en el cuarto día orino normalmente, orina libre de la sangre del perro. El día 10 el quiste y el tumor se redujeron en tamaño, y después de 1 mes que habían desaparecido por completo. Aunque la próstata se convirtió de una manera insignificante más pequeña, el perro no mostró signos de enfermedad. En este punto, es interesante observar que los valores séricos de preterapia muy elevados para el aspartato aminotransferasa (497? Mol / l) y alanina aminotransferasa (433? Mol / l) disminuyó después de 1 mes de la terapia de MZ a los niveles normales (16 y 43? Mol / l) y se mantuvo en el rango normal para todo el período de observación (5 meses).

Otro perro (caso 2) tenía, además de tumor de próstata, un tumor de testículo. El testículo fue de aproximadamente 20 cm de diámetro cuando se inició el tratamiento con MZ. Después de 1 mes de terapia el tamaño de los testículos se redujo en un tercio. Después de 2 meses de tratamiento el testículo se redujo en tamaño a la mitad y después de 3 meses a un tercio de su tamaño de pretratamiento (Fig. 8A). Sin embargo, la próstata sigue siendo igual de grande.

El tercer perro (caso 1) diagnosticado de próstata adenocarcinoma llegó a la clínica en un estado general muy malo. Sólo se orinaba con gran dificultad. Después de 1 mes de terapia clásica ninguna mejora fue observado. Se colocó un catéter en la uretra del perro. La terapia se continuó durante 2 semanas, pero no funcionó. El perro estaba Finem ante y los propietarios solicitaron la eutanasia. entonces la terapia clásica se sustituye por MZ terapia (3 × 200 mg / día). Después de 1 semana se observó una mejoría en general, y se retiró el catéter. Después de 14 días de tratamiento no hay signos de enfermedad eran todavía visibles. La terapia continuó durante un período adicional de 14 días, con la mejora de la salud todos los días. A continuación, los propietarios decidieron sobre la castración (en la mayoría de los casos la castración elimina problemas relacionados con la próstata), y se detuvo el tratamiento con MZ. Ocho meses más tarde, el perro sigue vivo y sin ningún problema grave de salud.

Tres perros sufrían de tumores de la piel. Uno de ellos (caso 11) tenía tres lesiones nódulos en la piel por encima de la cola. Dos de ellos fueron removidos, y el tercero, el más pequeño, fue dejado. Histológicamente el tumor fue diagnosticado como cancerígena planocellulare. Después de 1 mes de tratamiento con MZ el tumor-cereza tamaño fue reducido de tamaño en un tercio.Durante 5 semanas después de la lesión desapareció completa- mente. El perro sigue siendo (7 meses este último) bajo terapia. El perro en la actualidad 11 años, es muy vivaz y en inusualmente buenas condiciones.

Otro perro (caso 10) sufrió de adenocarcinoma en la piel de la cola, que fue eliminado quirúrgicamente. Sin embargo, incluso 2 semanas después de la cirugía la herida no sanó, y se consideró la amputación. El perro era entonces dado MZ en cápsulas y en polvo MZ también se aislaron en la herida. La herida sanó dentro de 1 semana. El tercer perro (caso 12) tenía un tumor en la lengua de aprox. 2 cm de diámetro. Histológicamente era planocellulare carcinoma. Después de la extirpación quirúrgica del tumor la herida no sanó. El perro se le dio MZ por vía oral en cápsulas, y en polvo MZ se aplicó también a nivel local. Cinco días después, la herida de biopsia ya no era visible.

Un perro de 5 años (caso 13), diagnosticado tienen aumentado (nodo tamaño de una nuez) a la izquierda de la glándula salival, fue tratado con terapia convencional para 4 meses, sin éxito. Durante ese tiempo, la glándula se hace más y más grandes, y el perro se desarrolló graves problemas para tragar y salivación. Después de sólo 1 semana de terapia MZ el nodo de ser más suave y más pequeño en una tercera parte. Después de una 1 semana el nodo desapareció por completo, y sólo la cápsula era palpable (Fig. 8B). 

Adenocarcinomas mamarios, en forma de nódulos múltiples (en tamaños entre la de las judías verdes y grandes nueces), fueron diagnosticados en seis perras. Después se inició el tratamiento con MZ, los nódulos desaparecieron por completo: en un perro después de 10 días, sin signos de enfermedad, incluso después de 12 meses; en cuatro perros después de 2-3 meses (nódulos más pequeños) y 4-6 meses (nódulos más grandes), sin signos de la enfermedad a partir de entonces, en el presente, 2 meses; y en un perro los nódulos se redujeron en tamaño a 50% después de 58 días de tratamiento.  En un caso de un perro (caso 14) con cáncer de pulmón, de nuevo, después de sólo 14 días de tratamiento con MZ (4 × / Día) los signos 400 mg de tumor desapareció completamente.

Además de los efectos de MZ expresa en la enfermedad primaria, todos los perros, incluso aquellos en los que la enfermedad primaria no se curó, respondió a la terapia MZ en sólo unos 7 días con la mejora constitucional y del comportamiento general de duración, incluso después de la terapia fue interrumpido. Lo mismo se observó para algunos parámetros clínicos hematológicos y séricos medidos antes y después de la terapia. El hematocrito disminuido hasta el intervalo normal en el caso 1. Los valores muy altos de bilirrubina sérica total cayeron al rango normal en los casos 3 y 14, mientras que el cambio de urea en suero concentración se observó en los casos 11 y 13. La mejora más pronunciada se observó para aspartato aminotransferasa, alanina aminotransferasa, y fosfatasa alcalina de leucocitos, con valores preterapia normalizados después de la terapia se inició en casi todos los casos (números 1, 2, 3, 10, 13, y 14.;

Discusión

Numerosos compuestos naturales se utilizan comúnmente para el tratamiento de diversas enfermedades, incluyendo extractos de té y soja verde (para revisión ver [20]). Los resultados recientes indican que los productos dietéticos y compuestos antioxidantes también tienen un efecto beneficioso sobre todo en pacientes cáncer. En muchos casos, el mecanismo exacto de su acción no se entiende completamente. En este informe se estudió el efecto de las partículas de zeolita clinoptilolita natural desarrollo de varios modelos de cáncer in vivo e in vitro. Hemos encontrado que clinoptilolita zeolitas acto activado mecánicamente como agentes terapéuticos contra el cáncer en in vivo animal estudios y en modelos celulares de cultivo de tejidos.

La gama de efectos era variada, que van desde respuesta antitumoral negativa, a la normalización de los parámetros bioquímicos, la prolongación de la duración de la vida, y disminución en el tamaño mor tu-. Los mejores resultados en modelos animales se absorben en el tratamiento de cáncer de piel en los perros, sugiriendo que la adsorción de algunos componentes activos se responsable para la actividad MZ (acción de contacto directo). estudios complementarios realizados en cultivo de tejidos indicaron que el tratamiento MZ afecta a la proliferación y la supervivencia de varias líneas celulares de cáncer. La adición de MZ inhibió la proliferación celular de una manera dependiente de la concentración, en parte debido a la inducción de inhibidores de quinasas dependientes de ciclina, la inhibición de la expresión B / Akt y la inducción de muerte celular programada.

El trabajo descrito aquí se realizó con el no tóxico natural, alto contenido de sílice zeolita, clinoptilolita. Las partículas de zeolita fueron cargados negativamente en el intervalo de pH de neumáticos en- estudiado (pH 1-11). La microscopía electrónica mostró la ausencia de fibras, y la mayoría de las partículas eran redonda con superficie muy rugosa (datos no mostrados). La ausencia de partículas fibrosas, con carga positiva era alentadores ya que tales partículas están presentes en amianto y erionita zeolitas, que son altamente cancerígeno y mutagénico. Además, las partículas de zeolita activadas no catalizaron la producción de radicales hidroxilo, a diferencia del amianto o la erionita (datos no mostrados). Parece que la ausencia de partículas fibrosas capaces de producir radicales hidroxilo hace que esta muestra de zeolita no sea tóxica y no cancerígena, al menos cuando se aplica por vía oral.

Tal inactivación resultó en la inhibición del crecimiento y el pliegue in- en la apoptosis de las células cancerosas. La inhibición de Akt por tratamiento MZ se muestra sólo en la presencia de suero. Esto indicó que la adsorción de los componentes del suero puede ser uno de los mecanismos de acción MZ en estos experimentos. De hecho, la adición de EGF a un medio libre de suero condujo a la activación de Akt, que también fue bloqueada por MZ pretratamiento. La adsorción de moléculas que participan en las cascadas de transducción de señales, tales como las mareas inositol fosfatado y calcio, también podría contribuir a su eficacia terapéutica. estudios de adsorción de lípidos preliminares muestran que MZ son fuertes absorbentes de lípidos. Resultados similares son ob- servido con la adsorción de proteínas. Las modificaciones del pedido de membrana y las interacciones de otras proteínas con proteínas de membrana también podrían estar involucrados [21], ya que se necesita translocación de membrana para la activación de la proteína quinasa B / Akt. Se ha recientemente también se ha demostrado que la activación de fosfoinosítido 3 quinasa y Akt es responsable de la capacidad de las células epiteliales transformadas para sobrevivir sin la unión celular. Resultados recientes indican que la activación constitutiva de phosphoinositide- 3 quinasa en cinco líneas celulares de cáncer de pulmón de células pequeñas estudió fue responsable para el crecimiento rápido e independencia de anclaje de células de cáncer de pulmón de células pequeñas [22]. 

De acuerdo con esto, tratamiento MZ conduce a la inhibición de quinasa B vías de proteína Ki / Akt y posterior apoptosis en nuestro modelo celular. Aquí proporcionamos evidencia de que el tratamiento con MZ incrementa los niveles de p21WAF1CIP1 y p27KIP1 en los modelos de células tumorales. Aún no está claro si la inhibición de Akt está involucrado en la regulación de la expresión de p21WAF1CIP1 y p27 Kip1 inhibidores del ciclo celular. Los resultados preliminares también muestran que MZ adsorbe y desactiva el óxido nítrico y otros oxidantes. Además, recientemente se ha informado de que antioxidantes estimulan la activación de ciclina p21 inhibidor WAF1 / CIP1 [ 23]. Esta molécula es responsable de la detención del crecimiento celular, y su expresión en adenocarcinomas de pulmón de está positivamente correlacionado con el pronóstico optimista supervivencia. El presente estudio observó que la clinoptilolita activada induce moléculas supresoras de tumores (tanto p21 y p27).

Los mecanismos de acción de MZ in vivo siguen siendo en gran medida desconocido en este momento. Los resultados presentados aquí indican que la inhibición de la proliferación y la supervivencia de las células cancerosas puede ser parte de los mecanismos implicados en anti- efecto cáncer de compuestos MZ. Más estudios sobre varios otros aspectos de su acción incluyendo la posible acción moduladora de la inmunosupresión MZ se llevarán a cabo en el futuro. Tomados en conjunto, este informe caracteriza efectos celulares de los compuestos MZ en modelos de células de cultivo de tejidos y proporciona datos que apoyan un papel de zeolita natural como un agente terapéutico contra el cáncer en modelos de tumores in vivo.

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