Un efecto de Clinoptilolite en los medios celulares y los efectos consecuentes en las células tumorales in vitro

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1. RESUMEN

La clinoptilolita es una zeolita natural no tóxico con propiedades de un ionexchanger y adsorbente. Estudios anteriores mostraron que clinoptilolita podría ser un adyuvante en la terapia del cáncer. El objetivo de este estudio era definir efectos de clinoptilolita en medio celular sobre la viabilidad y actividad de las proteínas clave que regulan la supervivencia celular, la división celular y la respuesta al estrés celular. Los números de células viables, de síntesis de ADN y la actividad de EGF-R, PKB / Akt y NF • B se redujo, mientras que la apoptosis se incrementó en las células que se cultivaron en medio supplemneted con clinoptilolita. Estos resultados podrían deberse a la adsorción de algunos componentes del suero tales como EGF a clinoptilolita. En medio tratado sin suero el papel predominante de clinoptilolita es el de intercambio catiónico, es probable que afecta a los niveles de calcio y vías de señalización dependientes de calcio. Estos resultados están en línea con otros datos que confirman aumento de la apoptosis en las células incubadas en medio tratado. Juntos, los datos presentados aquí demuestran que la clinoptilolita afecta microambiente celular a través de mecanismos que dependen de las características de adsorción y de intercambio iónico de este material.

2. INTRODUCCIÓN

Alargamiento de una duración de la vida humana en promedio 20 º siglo, especialmente en los países occidentales industrializados (1), se acompaña con una mayor incidencia de enfermedades personas de edad avanzada (2). Entre ellos, los tumores malignos tienen un importante lugar de (3, 4). Por lo tanto, la conexión entre el envejecimiento y la aparición del tumor (5), así como una posibilidad de evitar el desarrollo del tumor mediante el control del medio ambiente, especialmente la contaminación y la nutrición, se investigó intensamente (6).

Investigación de las relaciones de nutrición / tumor tiene dos objetivos principales. En primer lugar, descubrir Ingredientes de alimentos que inducen la mutagénesis y la carcinogénesis, así como mecanismos de su acción (7, 8). En segundo lugar, la búsqueda de Ingredientes de alimentos y adyuvantes que fortalecen un mecanismo de resistencia a la carcinogénesis (9-11). Ejemplos de estas sustancias son estrógenos de la planta (12), flavonoides (12) y otros (13, 14), llamados nutracéuticos (15).

Zeolitas, grupo especial de nutracéuticos, son cristales microporosas naturales y sintéticos hidratados que contienen AlO 4 y SiO 4 tetraedros vinculados a través de los átomos de oxígeno común (16). Las zeolitas tienen propiedades para actuar como catalizadores, intercambiadores de iones, adsorbentes y mejoradores de la detergencia (17-21). Excepto para ser utilizado en diferentes aplicaciones industriales, se sabe que los silicatos y aluminosilicatos también poseen una actividad biológica. estructuras bien definidas y actividad catalítica hacen aluminosilicatos un sistema de modelo atractivo para proteínas y enzimas miméticos (22). La actividad biológica positiva más conocido de clinoptilolita natural es su acción como fármaco antidiarreico (23). Resultados recientes han demostrado que era muy eficaz como adsorbente de glucosa (24) y inmunoestimulador (25-28). Además, algunos resultados indican que los silicatos y aluminosilicatos inducen cambios en la expresión de genes cuyos productos están implicados en la señalización celular (29).

Se activan MAPK, PKC y SAPK (30), factores de transcripción como AP-1 o • F • B y proinflamatorias citoquinas IL-1 •• IL-6 y TNF • (31). Resultados muy importantes muestran efecto antitumoral de clinoptilolita y su papel potencial como adyuvante en la terapia contra el cáncer (27, 28, 32, 33). El objetivo de este estudio fue determinar la acción más de cerca natural de zeolita clinoptilolita en medio celular y los consiguientes efectos sobre las células tumorales in vitro. Quisimos determinar si el efecto clinoptilolita en las células tumorales es una consecuencia de su propiedad de intercambiador de iones y / o consecuencia de la adsorción de microambiente celular.

3. Materiales y métodos

3.1. Líneas celulares

fibrosarcoma de ratón (EFS), carcinoma de células pequeñas (SCC VII) (presente de Prof. Dr. Mladen Korbelik, Vancouver, Canadá), carcinoma de páncreas humano (MiaPaCa-2) las células y los fibroblastos diploides normales (WI38) se mantuvieron en Eagle modificado de Dulbecco medio DMEM (Gibco, SAD) con 1,000 mg / ml de glucosa, 10 mM HEPES (Sigma, SAD), L-glutamina 2 mM, 500 U / ml de penicilina (Pliva, Zagreb, Croacia) y 500 mg / ml de estreptomicina (Pliva), suplementado con 5% de suero fetal bovino (FBS; Gibco) y suero bovino recién nacido al 5% (NBS; Gibco).

3.2. Clinoptilolita

El polvo clinoptilolita (Zeocem, Bystre, Eslovaquia), obtenido por micronización tribomechanical (zeolita micronizada; MZ), contenía 85% de clinoptilolita y 15% de sílice, montmorillonita y mordenita zeolita. Composición química de MZ se determinó por el espectroscopía de absorción atómica: 50-55% SiO 2, 9.3 a 11.4% de Al 2 O 3, 2.2 a 2.8% Fe 2 O 3, 0,8-1,1% Na 2 O, 2.9 a 4.3% K 2 O, 0,8-1,2% de MgO, 13,7 a 17,2% de CaO, 0,07-0,90% MnO, 0,14-1,22% TiO 2 y 14-16% H 2 O (800�C). El setenta y cinco por ciento de las partículas tenía tamaño de hasta 3 • m, tamaño medio de partículas de 2,5 • m, y 25% de polvo se consistía en partículas que tamaño era menos, 1,5 • metro. superficie de la partícula específica era 1,35 m 2 / sol. Agua destilada y / o medios de comunicación se trataron previamente con clinoptilolita (MZ) por la rotación durante la noche a temperatura ambiente, se centrifugaron 5 minutos a 1500 g (centrífuga Eppendorf, 5810R, Eppendorf, Alemania) y los sobrenadantes se filtraron a través de 0,2 • m filtro (Sartorius, Alemania).

3.3. Los anticuerpos

Conejo anti-pAkt y anti-pJNK1 / 2 (New England Biolabs) y el ratón anti-pERK1 / 2, anti-PKB / Akt, se utilizaron anti-ERK1 / 2 y anti-JNK1 / 2 (Santa Cruz, EE.UU.). NF • subunidades B fueron detectados utilizando antip65 monoclonales y anticuerpos anti-p50 policlonales (Transduction Laboratories, EE.UU.). tirosina fosforilada se detectó usando 4G10 anticuerpo (Upstate Biotechnology, EE.UU.) y EGF-R con el anticuerpo anti-RK2 policlonal (de Dr. Ivan Dikic Laboratory). Peroxidasa de rábano picante proteína marcada A (Amersham, EE.UU.) y (Amersham) en 5% de leche-IgM anti fueron utilizados para la detección y la proteína A Sepharose 4B (Zymed, EE.UU.) para la inmunoprecipitación.

3.4. Ensayo MTT

Medio con suero se trató previamente con 20 mg / ml y 50 mg / ml clinoptilolita. agua destilada fue pretratada de la misma manera y al día siguiente se utilizó para la preparación de un medio fresco con suero.

EFS y SCC VII, las células WI38 MiaPaCa-2 y (5x10 3, 6x10 3 y 1.4x10 4 células / pocillo, respectivamente) se sembraron en placas de 96 micropocillos (Greiner, Alemania) en cuadriplicados. Después de una incubación durante la noche, medio estándar se reemplazó con medio o medio MZ-pretratada preparada a partir de agua pretratada-MZ. Tanto los medios no tratados se utilizaron como controles. Después de la incubación de 24, 48 y 72 horas la viabilidad celular se midió usando el ensayo MTT como se describe previamente (27). La viabilidad celular se expresa como un porcentaje de absorción de MZ pretratados, en relación con la absorbancia de células de control. Los experimentos se repitieron tres veces y los resultados se analizaron estadísticamente con ANOVA, prueba de Tucker. La significación estadística fue p≤0,05.

3.5. Ensayo de incorporación de timidina

Para determinar la síntesis de ADN, 10 4 / así se sembraron células en placas de EFS 96microwell. Después se incubaron las células de hambre durante la noche en medio libre de suero y MZ-pretratados y medio no tratado con suero durante 5 minutos, 10 minutos y 24 horas. Las células se incubaron a continuación con timidina radiactiva (1 • Ci / ml) ([metil- 3 H] -timidine de 1 concentración mCi / ml, actividad específica de 82,04 Ci / mmol) NEN / DuPont, EE.UU.) durante 18 horas y se lava sobre el filtro (tiras de filtro de fibra Glas 240-1, Cambridge Technology, Inc., EE.UU. ) en PHD Cell Harvester (Cambridge Technology, Inc.) aparatos. Cantidad de radiactividad se midió en centelleador con centelleador líquido 0,1 mM de 1,4-bis [2- [2-metyl-5phenyloxazoyl] benceno] (Fisher Scientific, EE.UU.) y 18,1 mM 2,5diphenyl-1,3- oxazol (Beckman, EE.UU.) disuelto en la mezcla de tolueno (EM Science, EE.UU.) y Triton X-100 (Sigma, EE.UU.) (75:25 v / v).

3.6. Aislamiento de fragmentos de ADN de apoptosis

Se hicieron crecer células EFS y SCC VII en una placa de 10 cm por 24 cuatro patas, el medio se desecha y se reemplaza con medio pretratado-MZ o controlar con suero. Después de 24 horas las células se tripsinizaron y se aislaron fragmentos apoptóticos (34) y se visualizaron en gel de agarosa al 1%.

3.7. La estimulación celular y la lisis

Después se estimularon las células de hambre durante la noche con factores de crecimiento o medios MZ pretratados, se lavaron dos veces con PBS frío, se lisaron 10 minutos con tampón (50 mM Hepes pH 7,5; NaCl 150 mM; EDTA 1,0 mM; EGTA 0,2 mM; 1' % de glicerol; 1% Triton X-100; 1,0 mM Na-ortovanadato; PMSF 1,0 mM; 1,0 • aprotinina g / ml; 2 • g / ml leupeptina) y se centrifugó 15 minutos a 14.000 g. La concentración de proteínas se determinó con se prepararon método de Bradford y los lisados celulares totales. Por NF • determinación de la actividad B, nuclear y proteínas citoplasmáticas se aislaron. Las células se incubaron durante 5, 30 y 60 minutos en MZpretreated y DMEM sin tratar con y sin suero en placa de 10 cm, se lava con PBS, se lisaron en hielo 5 minutos con 300 • L de tampón (10 mM HEPES pH 7,9; KCl 10 mM; EDTA 0,1 mM; EGTA 0,1 mM; DTT 1 mM; PMSF 0,5 mM; mM Na-ortovanadato 1; 1.0 • aprotinina g / ml; 2.0 • g / leupeptina ml) y 9,375 • se añadió L de 10% de NP-40. Los lisados se agitaron con vórtex y se centrifugaron 3 minutos a 3300 g (Microfuge R, Beckman, Alemania). Los sobrenadantes (fracciones citoplasmáticas) se congelaron a -20�C antes de un análisis adicional. Después de gránulos (fracciones nucleares) se lavaron con tampón de lisis y se centrifugó como antes, 150 • se añadió L de tampón de Leammli a cada muestra.

3.8. Inmunoprecipitación

Las proteínas totales (300 • g) se mezclaron con 5 microlitros de anticuerpo anti-RK2 90 minutos a 4�C. Las muestras se mezclaron durante 30 minutos con 37 • L de proteína A / Sepharose, centrifugaron a 4�C y supernatatns se aspiraron con vacío. Las perlas se lavaron dos veces con tampón de lisis y una vez con TBS. Veinte microlitros de tampón de Leammli se añadieron a cada muestra, se agitaron con vórtex en breve, se incubaron durante 3 minutos a 98�C y se centrifugaron a temperatura ambiente.

3.9. Western blot

Un cantidad igual de proteínas celulares se separaron mediante SDS-PAGE y se transfirieron a membrana de nitrocelulosa. Las inmunotransferencias se bloquearon con TBS / BSA al 5% (10 mMris-HCl, pH 7,4; NaCl 150 mM) durante la noche a 4�C, se incubaron durante 90 minutos con anticuerpos primarios en TBS, se lavaron a fondo en TBS / 0,05% de Triton X-100 y se incubaron durante 1 hora con el anticuerpo secundario apropiado. Después de lavados adicionales, las inmunotransferencias se visualizaron utilizando mejorado reactivo de quimioluminiscencia (BoehringerManheim, Alemania). Las transferencias se volvieron a sondar por incubación en tampón de extracción (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,7; 2% de SDS; 100 mM 2-mercaptoetanol) a 58�C durante 25 minutos, el lavado con TBS, rebloqueo y con los anticuerpos apropiados. Las transferencias se cuantifican y se analizaron por el programa Imagemaster® VDS Software Versión 2.0 (Amersham).

4. RESULTADOS

4.1. medio celular clinoptilolita pretratados disminuye la viabilidad celular y la síntesis de ADN y aumenta la apoptosis

Para determinar si el efecto clinoptilolita es consecuencia de sus protestas de disolución y / o desorción o adsorción de moléculas / proteínas a partir de medio celular, agua destilada y medio fueron pretratados con clinoptilolita. Mientras que el tratamiento durante la noche clinoptlilolite no afectó el pH del medio, aumentó significativamente el pH de agua destilada. sí incubación durante la noche no afectó el pH del agua o el medio. Aunque el sistema de tamponado de medio es suficiente para mantener el pH mediano, el cambio de pH del agua indica que clinoptilolita afecta a los iones en solución. Además, el ensayo de MTT (Figura 1) mostró que DMEM preparó a partir de agua pretratada no afectó a la viabilidad de las células, lo que indica que no se disuelve o no disuelto lo suficiente como para afectar a las células. Sin embargo, Después se observó disminución de la viabilidad, se midieron la síntesis de ADN y la apoptosis. Mientras que la presencia de suero aumentó la síntesis de ADN en células de EFS, incubación de 5 minutos en un medio MZ-previamente con suero disminuyó la síntesis de ADN en comparación con el medio con suero.

Después de 12 hora que se redujo aproximadamente 30% (datos no mostrados). Después de 24 horas de incubación de las células EFS y SCC VII en medio pretratado-MZ y no tratada con suero, la apoptosis se demostró en ambas líneas celulares (datos no mostrados). Sin embargo, fue más prominente en células EFS (donde el ADN no fragmentado todavía estaba presente). Estos resultados indican que el medio pretratado-MZ provoca la inhibición de la proliferación y activación de la apoptosis, al mismo tiempo, y están de acuerdo con resultados de ensayo de MTT.

4.2. La señalización celular

Dado que las células EFS y SCC VII mostraron respuesta diferente, que fueron elegidos para el análisis de las vías de señalización intracelular. Se analizó el efecto de los medios pretratados-MZ en la supervivencia (PKB / Akt1 / 2), mitogénica (ERK1 / 2) y el estrés (JNK1 / 2) vías, así como la actividad de EGF-R en estas células de señalización.

Primero, las células EFS y SCC VII se incubaron en medio sin tratar y MZ pretratada con suero (figura 2). PKB / Akt se redujo ligeramente después de 1 minuto y se redujo adicionalmente en ambas líneas celulares después de 30 y 60 minutos de incubación. El efecto fue más prominente en células EFS. Se obtuvieron resultados similares con la actividad de ERK1 / 2. PKB / Akt actividad se incrementó en respuesta a EGF, insulina y suero (datos no mostrados). En otro experimento, después de 30 minutos de incubación en medio MZ-pretratados con suero, 5 minutos de la incubación con factores de crecimiento EGF y PDGF restauraron la actividad de PKB / Akt en EFS, pero no SCC VII células. / 2 y JNK1 / 2 actividades ERK1 también eran diferentes en EFS y SCC VII células. Mientras / 2 actividad ERK1 en las células EFS se redujo, se aumentó ligeramente en SCC VII células después de 30 minutos de incubación en medio pretratado-MZ. Sin embargo, JNK1 / 2 Actividad se redujo significativamente en SCC VII células, mientras que se mantuvo sin cambios en las células EFS (datos no mostrados). Los factores de crecimiento restauraron su actividad en ambas líneas celulares. Estos resultados sugieren que el medio pretratado no se activa vía de la tensión en ninguna línea celular. Sin embargo, diferentes resultados obtenidos con ERK1 / 2 y JNK1 / 2 actividad en EFS y SCC VII células sugieren que clinoptilolita podría actuar en diferentes MKK en estas células (es decir, MKK4 y MKK7 en SCC VII células y MKK1 y MKK2en células EFS).

Capacidad EGF para revertir los efectos MZ sugirió que el efecto podría estar asociado con la vía del EGF-señalización. Sin embargo, la actividad de EGF-R en ambas líneas celulares incubadas en el medio pretratado con suero no era cambiado significativamente. Para investigar más a fondo la hipótesis de que la disminución de PKB / Akt actividad fue una consecuencia de la interacción clinoptilolita con componentes del suero, se utilizó EGF como un sistema modelo. En primer lugar, EGF se incubó durante la, noche en el medio sin suero. Después de 5 minutos de incubación de las células en ese medio, EGF fue capaz de activar PKB / Akt y ERK1 / 2 (figura 3). Sin embargo, cuando EGF se incubó durante la noche en el medio junto con clinoptilolita, observado previamente efecto de EGF sobre la PKB / Akt y ERK1 / 2 Actividad fue disminuido. Estos resultados implicaron que el mecanismo de acción clinoptilolita era adsorción factores de crecimiento. Esto se confirmó adicionalmente mediante la medición de la actividad de EGF-R en las mismas condiciones (figura 4). Mientras EGF activa EGF-R, la incubación durante la noche con clinoptilolita EGF no activar EGF-R.

Adicionalmente, se determinó la actividad de PKB / Akt y ERK en EFS y SCC VII células incubadas en medio sin tratar y tratada previamente-MZ sin suero. No había diferencia en FSAR control en comparación con el control de SCC VII células, porque PKB / Akt actividad estaba disminuyendo en células EFS en el tiempo (opuesto de su actividad en las células EFS incubadas en medio con suero), mientras que se aumenta en el control de SCC VII células (el mismo que en las células SCC VII incubadas en medio con suero). PKB / Akt Actividad fue aún más disminuida en células EFS incubaron en medio pretratado-MZ entonces en las células control. Sin embargo, en SCC se aumentó en comparación VII células PKB / Akt actividad para controlar SCC VII células después de 1 y 5 minutos de incubación, empezó a disminuir después de 30 minutos y se redujo significativamente después de 60 minutos de incubación (datos no mostrados). En las células EFS ERK1 / 2 Actividad se incrementa transitoriamente después de 30 minutos de incubación en medio pretratado-MZ sin suero. Mientras que la actividad de ERK1 / 2 en SCC de control VII células está disminuyendo en el tiempo, su actividad en VII SCC células incubadas en medio pretratado-MZ está ya aumentó ligeramente después de 5 minutos de incubación y se está haciendo más incerased en el tiempo (datos no mostrados).

Estos resultados fueron opuesta a los resultados obtenidos con medio MZ pretratada con suero. La diferencia fue más prominente en las células SCC VII. factor de transcripción NF • B se coloca en el citoplasma en su forma inactiva, unido a su inhibidor I • B. Se puede activar con PKB / Akt, que promueve la supervivencia de las células. Para investigar los posibles objetivos de abajo de PKB / Akt, que participan en la vía antiapoptótica procedió a analizar NF • actividad B en SCC VII células se incubaron durante 5, 30 y 60 minutos en MZ pretratada medio con y sin suero. Los resultados han demostrado que NF • B se activa después de 30 minutos en medio sin suero, aunque su activación es aún mayor en el medio con suero. Sin embargo, ambos medios MZ pretratada disminuyeron NF • actividad B después de 30 minutos de incubación (Figura 5).

5. DISCUSIÓN

La clinoptilolita es una zeolita natural no tóxico con propiedades de un intercambiador de cationes y adsorbente de proteínas y moléculas pequeñas. Posee una actividad biológica; que puede adsorber la glucosa (24), mejorar el síndrome diarreico (23), y actuar como un inmunoestimulador (25-28). Nuestros estudios anteriores mostraron que clinoptilolita podría ser un adyuvante en la terapia del cáncer debido a su anticáncer, antimetastásico y las propiedades inmunoestimulantes (27, 28, 32, 33). Suponemos que estos efectos son consecuencia de los cambios en la señalización celular influenciados por clinoptilolita. El objetivo de este estudio era definir el mecanismo subyacente a los efectos de clinoptilolita en medios celulares y los consiguientes efectos sobre la viabilidad celular y la actividad subyacente de proteínas clave implicadas en las rutas que regulan la división celular (ERK1 / 2), la supervivencia / apoptosis de señalización (PKB / Akt) y el estrés de respuesta (JNK1 / 2).

Nuestros resultados indican que la clinoptilolita cambia ion composición. Sin embargo, ya que incubación de células tumorales en el medio preparado a partir de agua clinoptilolita pretratada no afectó la viabilidad celular se asumió que la composición de iones modificado no era la causa principal de la muerte celular. medio con suero clinoptilolita pretratados, por otra parte, disminuyó significativamente la viabilidad de las células por la disminución de la síntesis de ADN con aumento concomitante de apoptosis. Esto es de acuerdo con los resultados previos obtenidos con líneas celulares humanas HeLa, CaCo2, HT-29 y MCF-7 (27). Este efecto no se ve influenciada por el origen de las células (ratón, humano) o por tipo de malignidad (fibrosarcoma, carcinoma, células normales) sino más bien por la tasa de proliferación celular. El mejor efecto se obtuvo con las células que proliferan los más intensamente (EFS y MiaPaCa-2).

Para investigar tal efecto en más detalle, se analizó la actividad de las proteínas clave implicadas en las vías de regulación de la supervivencia / apoptosis de señalización (PKB / Akt), la división celular (ERK1 / 2) y la respuesta al estrés (JNK1 / 2), así como NF • actividad B. El cambio más destacado se muestra con PKB / Akt y ERK1 2 actividad / que se disminuyó en ambas líneas celulares en comparación con los controles. Desde ERK1 / 2 actividad es NECESARIO para la proliferación celular (35, 36), este resultado está de acuerdo con el resultado de la disminución de la viabilidad de las células. Aunque no está claro si la disminución de ERK1 / 2 Actividad es una causa o una consecuencia de la síntesis de ADN disminuida, este resultado muestra que el medio pretratado se citostático y no citotóxico para las células. PKB / Akt es quinasa antiapoptótico que inactiva BAD proapoptótico (37, 38), caspasa 9 (39) y (40) las proteínas AFX, evitando la apoptosis. El otro mecanismo de PKB / Akt efecto antiapoptótico es la activación de NF • B factor de transcripción por • F • B (41, 42, 43) y / o su inhibidor I • B (44) de fosforilación. disminución simultánea de PKB / Akt y NF • actividad B en las células SCC VII está de acuerdo con el resultado de la disminución de la viabilidad de las células y confirmar la apoptosis de estas células en el nivel de señalización.

Mientras que PKB / Akt actividad se redujo en medio clinoptilolita pretratados con suero, la adición de factores de crecimiento reactivado PKB / Akt. Desde PKB / Akt se activa por EGF, PDGF y la insulina es probable que medio clinoptilolita pretratados afecta a las células debido a la clinoptilolita adsorción de estos factores de crecimiento. Se confirmó que por incubación de las células en el medio que se incubaron durante la noche con EGF / clinoptilolita. PKB / Akt, ERK1 / 2 y EGF-R fueron activados por EGF pretratada-, pero inactivados por EGF medio / clinoptilolita-pretratada. Clinoptilolita también podría haber adsorbido IGF1 que es el factor de crecimiento muy importante en el suero (45, 46, 47), también responsable de la resistencia al estrés oxidativo de las células (48). medio pretratado tenía efectos diferentes en ERK1 / 2 y la actividad de JNK1 / 2 en diferentes tipos de células. / 2 actividad ERK1 en SCC VII células fue menos sensible a la incubación en medio pretratada luego en células EFS. JNK1 / 2 la actividad no fue mayor en cualquiera de las líneas de células se incubaron en medio pretratado con suero; incluso se redujo en las células SCC VII. Por lo tanto, las vías de respuesta al estrés no se activan por medio pretratado con suero. PKB inducida por medio libre de suero clinoptilolita pretratados / Akt y la actividad ERK1 / 2 en las células SCC VII.

Aumento de la EGF-R y, en consecuencia, ERK1 / 2, la actividad se puede explicar por el aumento de la concentración de calcio en las células (49). Estos resultados están de acuerdo con los resultados obtenidos por el análisis de microrrayas (no mostrado) de SCC VII células cultivadas en medio libre de suero clinoptilolitepretreated y el control durante 24 horas, Calma y NHE1 genes en las células cultivadas en medio pretratado. Calma, Ca 2+ receptor, activa muchas fosfatasas y quinasas y, entre otros, activas proteínas BAD proapoptóticos. Por otro lado, NHE1 es Na + / H + intercambiador de iones, que se activa por el aumento de la concentración intracelular de Na +. Los resultados indican cambiada concentración de iones (muy probablemente Ca 2+ y Na +), tanto en el medio y las células. Sin embargo, diferentes efectos de los medios pretratados en diferentes líneas celulares podrían explicarse por diferente naturaleza de estas células. células EFS se utilizan para el modelo de inmunoterapia ya que son muy inmunogénicos (50) en contraste con SCC VII células (51). Ambas líneas celulares se utilizan como modelo para el examen de papel del óxido nítrico para la respuesta al tratamiento (52), porque SCC VII células generan relativamente grande y células EFS cantidades relativamente pequeñas de NO endógeno. Además, SCC VII células no expresan manosa-6-fosfato / receptor del factor de crecimiento II similar a la insulina (M6P / IGFII-R) que podría ser causa de su potencial metastásico. células SCC VII también son resistentes a la radiación, a causa de gran actividad de superóxido-dismutasa mitocondrial (53, 54). Algunas de estas propiedades también podrían subyacer una respuesta diferente de SCC VII comparación con las células EFS a los medios pretratados-MZ. P53 proteína supresora de tumores es responsable de la expresión de muchas proteínas (55), entre los cuales GADD45 (56) y CIP1 / WAF1 / p21 (57) expresión. Así, el aumento p53 la transcripción obtenida por el análisis de microarrays (no mostrado) está de acuerdo con nuestro resultado anterior de una mayor CIP1 / WAF1 / p21 expresión en células incubadas en medio clinoptilolita pretratada (27).

Curiosamente, el aumento p53 se encontró expresión en los tumores irradiados y tratados con paclitaxel SCC VII en vivo (58), aunque estas células no se someten a la apoptosis. Sin embargo, en conjunto, nuestros resultados sugieren que el SCC VII se sometió a la apoptosis. En conclusión, hemos demostrado que el efecto clinoptilolita es, al menos parcialmente, debido a la adsorción de los factores de crecimiento a partir de suero en el medio. También cambia la concentración de calcio en el medio. Todos estos cambios disminuyen PKB / Akt, ERK1 / 2 y NF • actividad B. Se ha demostrado previamente que los ratones y vacas alimentadas con comida zeolita, suplementada habían cambiado composición de iones de suero (59, 60). Nuestros resultados, explican parcialmente efecto clinoptilolita en suero, líquido extracelular y el líquido en el tracto gastrointestinal. La adsorción de sustancias activas a partir de suero o intestino es importante, mecanismo de acción clinoptilolita. Además, hemos demostrado relativa insensibilidad de las, células normales a clinoptilolita efecto en comparación con las células tumorales. También, cambiado las concentraciones de iones en microambiente celular, e indirectamente en las células, los, cambios de actividad de las vías de señalización. Propiedades de clinoptilolita para influir en las vías de señalización e induce inmunidad también puede explicar el efecto clinoptilolita en la, cicatrización de heridas.

6. RECONOCIMIENTO

Este trabajo fue apoyado por el ministro croata de Ciencia y Tecnología, otorga 98095 y 98093. Agradecemos Mihaela Alivojvodic para la ayuda técnica y apoyo, y el Sr. Aaron Etra por su, ayuda en la preparación de este manuscrito. Agradecemos también a dr. A. Dietz y el dr. S., VukPavlovic para los debates y la preparación del manuscrito útiles.

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