PROPIEDADES ANTIVIRALES DE CLINOPTILOLITE

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Magdalena Grce- Kresimir pavélico

 

Rodjer Boskovic, Institute Devision de Molecular Medicine, Bijenicka54 HR-10002Zagreb, Croacia. Recibido14 de agosto de 2004; receiveel 11 de octubre de 2004; aceptado el 26 de octubre de 2004.

 

Abstracto

 

El objetivo de este estudio fue evaluar las propiedades antivirales de la clinoptilolita, una zeolita natural no tóxica.  En este documento, se obtuvo un polvo fino de zeolita Micronizada (MZ) por micronización tribomecanica de clinoptilolita natural. Se trataron suspensiones virales con MZ en concentraciones que oscilaban entre 0,5 y 50 mg/ml. La proliferación se evaluó con un microscopio óptico como porcentaje del efecto citopático (CPE). El adenovirus humano 5, el virus del herpes simple tipo 1 (VHS) y los enterovirus humanos (coxsacievirus B5 y echovirus 7) se utilizaron en el ensayo antiviral. Las concentraciones de 0,5 y 5 mg/ml de MZ indujeron un efecto antiviral muy bajo o el antiviral no se observó en absoluto, mientras que concentraciones de 12.25 y 50 mg/ml de MZ en efecto inhibitorio significativo sobre la proliferación viral. MZ inhibido la proliferación del VHS1, el coxsackievirus B5 y el echovirus 7, de manera más eficiente que el adenovirus 5. El efecto antiviral de MZ parece no ser específico y es más probable que se base en la incorporación de partículas virales en los poros de los agregados de MZ que en el intercambio iónico. Nuestros resultados preliminares indican una aplicación de interpretación terapéutica de MZ, ya sea localmente (piel) contra infecciones como herpes virus o por vía oral en los casos de infecciones por adenovirus o enterovirus. Además, MZ también podría ser utilizado en la purificación agua potable de diferentes virus.

 

1-    Introducción

 

 

La clinoptilolita es una zeolita natural no tóxica que tiene simetría de estructura cristalina monoclínica y fuerte capacidad de absorción de un intercambio iónico. Estas propiedades han sido ampliamente explotadas tecnologías industriales, agrícolas, ambientales y biológicas. Las zeolitas también poseen actividad biológica, ya sean positiva o negativa. La actividad biológica positiva más conocida y documentada de la clinoptilolita natural es acción como fármacos antidiarreicos. Además, algunos de ellos parecen tener propiedades antibacterianas. La clinoptilolita de Vranje, Serbia, utilizada en este estudio tiene efectos antioxidantes y inmunoestimuladores, y ha sido utilizado como adyuvante en la terapia contra el cáncer.

 

La clinoptilolita administrada por intubación gástrica a ratones inyectados con células de melanoma redujo significantemente el número de metástasis de melanoma. El tratamiento con clinoptilolita de ratones y perros que sufren de una variedad de tipos de tumores condujeron a una mejoría en el estado general de salud, a la prolongación de la vida útil y disminución del tamaño del tumor. La aplicación local de clinoptilolita a cánceres de piel de algunos perros redujo efectivamente la formación y el crecimiento de tumores.

 

El principal efecto biológico negativo de la clinoptilolita podría ser su toxicidad en organismos superiores (mamíferos) si el contenido de metales pesados (Pb, Cd, Zn, etc.) es alta, por lo tanto, se realizó un estudio clásico de toxicidad crónica de clinoptilolita de Vranje Serbia en ratones y rata. Los resultados que la administración oral (en dieta) administración de clinoptilolita a ratones y ratas durante 6 y 12 meses, respectivamente, no causo cambios que podrían considerarse un efecto tóxico de tratamiento.

En base a estos resultados asumimos que las cualidades adsorbentes y una propiedad de intercambio iónico de clinoptilolita podría ser efectiva en virus. Aquí probamos una clinoptilolita natural (Vranje, Serbia) en replicación viral in vitro del adenovirus, herpes virus y enterovirus.

  Experimental

 

2.1 clinoptilolita natural

Se obtuvo un polvo de clinoptilolita natural, es decir, zeolita micronizada (MZ) mediante micronización tribomecanica de clinoptilolita natural de Vranje, Serbia. composición química y características de MZ han sido descritos previamente.

 

2.2 líneas celulares

Se utilizaron células de carcinoma cervical humano (HeLa; número CCL-2) y células epilépticas de riñón de mono verde africano células apitelílicas BS-C-1; Número ATCC: CCL-26). Las células se propagaron en el medio de cagle modificando de Dulbecco (MEM; Gibco BRL, EE.UU.) Suplementado con 10% de suero bovino fetal inactivo (FBS; Gibco BRL, EE.UU.) 1% L-glutamina y 0,3% bicarbonato sódico  a 37°C y 5% CO2.

2.3 Virus

Adenovirus 5 (número ATCC: VR-5) herpes virus tipo 1 (VHS 1; Número ATCC: VR-733) y dos enterovirus, virus coxsackievirus B5 (número ATCC: VR- 185) y echovirus 7 (número ATCC: VR-37) se incluyeron en este estudio. El adenovirus y el herpes virus se propagaron en HeLa, mientras que el enterovirus se propago en monocapa de células confluentes BS-C-1.  La suspensión viral consistió en el sobrenadante libre de células recogido después de la centrifugación (20 min,4°C, 5000 X g) de medios infectados (MEM complementado con 2% FBS) recogido en la proliferación viral máxima, es decir, 100% efecto citopático (CPE) de monocapa de célula entera. Cinco títulos virales relativos diferentes (V1_V-4) obtenidos mediante dilución en serie de la suspensión viral (1:2 adenovirus y herpes virus y 1:10 para enterovirus) fueron tratados con MZ antes del ensayo antiviral.

 

2.4 Tratamiento MC

Debido a la sedimentación de clinoptilolita en su suspensión de agua, no es posible tratar un cultivo celular con MZ y seguir los cambios morfológicos de las células tras la infección viral. por esta razón, diferentes títulos virales (V1-V4) Y MEM suplementados con el 2% de FBS (control negativo) fueron tratados con MZ a concentraciones que van desde 0.5 a 50 mg/ml. Después de la incubación (15 h, 4°C, rotación constante), la suspensión (medio y Mz) se centrifugo (10 min, 4°C, 3000 x g) para separar el líquido de la fase sólida.

2.5 Ensayos Antivirales

Se sembraron células HeLa y BS-C-I a 2 x 10 células por ml en placas de microtitulacion de fondo plano de 24 pocillos (Becton Dickinson EE. UU.) La infección se realizó en monocapa de células confluentes de un día de edad. Las placas se incubaron a 37°C y 5% de CO, y el CPE fue seguido de microscopia óptica cada 24 h durante 3-a días (dependiendo del tipo de virus). Cada ensayo se realizó cuatro veces. El efecto inhibidor de la proliferación viral se evaluó como porcentaje de CPE y se comparó con el CPE de diluciones similares de suspensión viral también incubadas a 4°C durante 15 h, pero sin MZ (control positivo. proliferación.

3. Resultados y Discusión 

Se eligieron cuatro virus diferentes en función de su morfología y características biológicas:

(a) con o sin envoltura de lipoproteína adquirida de la célula huésped,

(b) virus replicantes de ADN o ARN,

(c) alta infectividad u CPE relativamente rápido en cultivo celular.

La cápside del herpes virus está rodeada por una envoltura de lipoproteína, que varía en su tamaño de 100 a 200 de diámetro y su genoma consiste en ADN lineal con doble cadena. Los adenovirus y los enterovirus (coxsackievirus echovirus) son virus sin envoltura y relativamente pequeños (65-80 y 22-30 nm de tamaño de virión, respectivamente), en comparación con los herpes virus. El genoma de los adenovirus consiste en ADN lincar de la doble cadena, mientras que de los cirovirus consiste en ARN monocatenario. Los enterovirus son altamente infecciosos y el CPE especifico (lisis celular) aparece en el cultivo celular (BS-C-I) raídamente, dentro de las 24-48 h dependiendo del título viral (dilución serial 1:10). los adenovirus y los herpes virus son menos infecciosos que los enterovirus y el CPE especifico (redondeo celular) aparece en el cultivo celular (HeLa) dentro de las 24-72 h, dependiendo del título viral (dilución en serie 1:2) El CPE del adenovirus 5 y el herpes virus tipo 1 (HSV 1) se observó en las células Hela, mientras que CPE del coxsackievirus B5 y el echovirus 7 en las células BS-C-I. La influencia de clinoptilolita en la proliferación viral depende tanto de la concentración de MZ (CMZ, que varía de 0.5 a 50 mg/ml) como título viral (que varía V1 A V4) es decir el efecto antiviral. el efecto antiviral fue mayor concentración de clinoptilolita (50mg/ml) y el titulo viral más bajo (V. los porcentajes observados de efecto antiviral también dependiendo del tipo de virus.

Las consecuencias de 25 y 50 mg/ml de MZ indujeron una inhibición significativamente mayor de CPE de la mayoría de los virus tratados, excepto al adenovirus 5. Se observo la inhibición máxima de 28.6% y 42.9% de CPE de adenovirus 5 en el titulo viral más bajo (V) tratando con nd 50 mg/ml de MZ, respectivamente. Concentraciones de 25 y 50 mg/ml de MZ indujeron un alto efecto inhibitorio de CPE de HSV I de 83.3% (V y 85.7%) (V) respectivamente. Del mismo modo, concentraciones de 25 y 50 mg/ml MZ indujo el mayor efecto inhibitorio de CPE, hasta 100% (tablas 3 y de coxsackievirus B5 y echovirus 7.

Nuestro estudio indica un efecto inhibitorio de Mz sobre la proliferación viral. El efecto inhibitorio estuvo representado inhibición de CPE viral especifico en cultivo celular en comparación con el mismo sin tratamiento con MZ. Mencionado anteriormente, el efecto inhibidor de MZ depende de la concentración de MZ (0.5-50 mg/ml), el tipo y la concentración de virus (título viral que varía de V1-V4). Se observo una inhibición significativa de la proliferación viral superior al 50% con una concentración de MZ superior al 12 mg/ml. el tratamiento suspensión viral de adenovirus 5 con MZ no indujo ninguna inhibición significativa de la proliferación viral contraria al HSV 1. coxsackievirus B5 y echovirus 7. la inhibición de la proliferación viral probablemente debe ser inespecífica e independiente del tamaño del virión, la estructura del genoma. Como Mz consiste en una mezcla de partículas de aproximadamente 1 um de diámetro y un tamaño de poro interno de 0.35 nm, probablemente se incorporaron viriones que varían de 20 a 200 nm en el agregado de zeolita mesoporosa y/o se adsorbieron en la superficie de sus cristales. Microestructura durante el tratamiento de 15 h de medios de cultivo infectados con virus. Esta sería la explicación más plausible que se utiliza un fenómeno similar en el método de concentración vial mediante la captura de polvo de vidrio de borosilicato, aunque el tamaño de partícula es mucho mayor (100-200 um). Además, MZ adsorbe minerales y aminoácidos esenciales de los medios de cultivo. La inhibición de la proliferación de viriones en la microestructura cristalina MZ requiere más investigación (análisis de microscopia electrónica, por ejemplo).

Otro posible mecanismo de acción de MZ sobre partículas virales es su capacidad de intercambio iónico que podría desestabilizar la morfología de las partículas virales, a saber, dado que la estructura de las lipoproteínas (envoltura viral) es menos resistente al medio ambiente que la proteína (capsula viral), este podría explicar por qué el herpes virus (envueltos) estaban más desestabilizados que los adenovirus (no envueltos) por MZ. Sin embargo, esta teoría no es completamente precisa por que la proliferación de enterovirus (coxsackievirus B5 y echovirus 7), también los viriones no envueltos, fueron inhibidos casi por igual por MZ como lo de los de herpes virus (HSV1). Por lo tanto, en tales medios de cultivo empobrecidos, la viabilidad viral y la infectividad se reducen. El mecanismo exacto de acción de MZ basado en la propiedad de intercambio iónico de su interacción con partículas virales en una solución acuosa (medios de cultivo), necesita más investigación, análisis bioquímico extenso de los medios y cambios en el virión. Los mecanismos de acción de MZ sobre diferentes tipos de virus son probablemente no específicos, lo que lo hace más interesante que el medicamento antiviral convencional. Tal inactivación de partículas virales por MZ seria extremadamente interesante para los virus que infectan tracto digestivo como los enterovirus y los adenovirus debido a que MZ puede administrarse por vía oral sin toxicidad, podría usarse con fines terapéuticos. Además de eso MZ podría usarse como terapia antidiarreico natural tradicional como la arcilla y el carbón activado. Los herpes virus pueden establecer una latencia de por vida después de la infección primaria que puede reactivarse especialmente en receptores de trasplantes inmunocomprometidos y pacientes con VIH. en general las infecciones por herpes virus se han tratado con éxito con la administración sistemática de aciclovir. Sin embargo, las variantes de resistencia a los medicamentos surgen después del tratamiento a largo plazo, lo que conduce a fracaso del tratamiento. esta es la razón por la que nuevos medicamentos potenciales eficientes y económicos, como MZ, podrían ser útiles para inhibir si no erradicar las infecciones virales. Además, MZ podría administrase localmente en la piel como crema o gel para inhibir infecciones recurrentes de herpes virus genitales y labiales que a menudo son psicológica y físicamente muy dolorosas.

 

4. Conclusión

Nuestros resultados preliminares indica una propiedad antiviral de clinoptilolita que abre la posibilidad de la aplicación terapéutica de MZ ya sea localmente (piel) contra infecciones por herpes virus o por vía oral en infecciones por adenovirus o enterovirus. 

Sin embargo, el efecto inhibidor de la proliferación viral se observó con una alta concentración de MZ (más de 12 mg/ml), lo que hace que las aplicaciones clínicas y el efecto dosis-respuesta difícilmente de establecer. Afortunadamente, MZ podría usarse en la purificación de agua potable de diferentes partículas virales sin preocuparse de la concentración de MZ para la aplicación.

 

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