Efecto inmunoestimulante de la clinoptilolita natural como un posible mecanismo de su capacidad antimetastásica

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INTRODUCCIÓN

Las zeolitas se hidratan cristales microporosas naturales y sintéticas con estructuras bien definidas que contienen AlO4 y SiO4 tetraedros unido a través de los átomos de oxígeno común (Breck 1964). Las zeolitas tienen propiedades para actuar como catalizadores, intercambiadores iónicos, adsorbentes, y mejoradores de la detergencia (Colella 1999; Garces 1999; Flanigen 1980; Naber et al 1994;. Sersale 1985). Aparte de ser utilizado ampliamente en aplicaciones industriales diferente, se sabe que los silicatos y aluminosilicatos también poseen actividad biológica, ya sea positiva o negativa. La  estructura bien definida multado y actividad catalítica hacen aluminosilica que un sistema de modelo atractivo para proteínas y enzimas miméticos (Bedioui 1995). Resultados recientes han demostrado que la zeolita era muy eréctil como un adsorbente de glucosa (Concepción-Rosabal et al. 1997), así como un adyuvante potencial en la terapia contra el cáncer (Pavelic et al. 2001). Las zeolitas reversiblemente unen moléculas pequeñas tales como el oxígeno o el óxido nítrico, que poseen tamaño y forma selectividad, la posibilidad de mimetismo metal o enzima, y ​​la actividad inmunomoduladora (Ozesmi et al. 1986). La acumulación de pruebas ha indicado que las zeolitas desempeñar un papel importante en la regulación del sistema inmune. Se informó de que la sílice, silicatos, y aluminosilicatos actúan como inmunoestimuladores no específicos similarmente a superantígenos (Ueki et al. 1994). Los superantígenos (SAG) son una clase de inmunoestimulador y causantes de enfermedades proteínas de origen bacteriano y viral con la capacidad de activar una fracción relativamente grande (5-20%) de la población de células T. La activación requiere interacción simultánea de la SAG con el dominio V de complejo célula T clase (MHC) II moléculas en la superficie de las células presentadoras de antígeno (Ueki et al., 1994). macrófagos proinflamatorios, que pertenecen a la clase II MHC células presentadoras de antígeno, se activan por fibrinógeno partículas de silicato (Allison et al 1996; Drumm et al., 1998). 

Se ha demostrado que la exposición de los macrófagos alveolares a partículas de silicato conduce a la activación de las quinasas mitógeno activada de proteína (MAPH), proteína quinasa C, y proteínas quinasas activadas por estrés (Saf) (Lim et al. 1997). Los factores importantes de transcripción tales como AP-1 y NFkB también se activan en las células epiteliales de pulmón, y se mejoró expresión de citoquinas proinflamatorias tales como IL-1a, IL-6 o TNF-a (Simeonova et al. 1997). Modificaciones de la cinética de la activación del receptor o la actividad de las integrinas pueden ser responsables de la observaron tratamiento. Alternativamente, se muestran partículas envueltos por fagocitosis para estimular la producción de especies de oxígeno reactivas (ROS) que se han encontrado para ser segundos mensajeros importantes para la transducción de señales en general (Martin et al., 1997). Las alteraciones en la estasis del redox de células pueden desempeñar un papel importante en la modulación de las funciones inmunes. Por ejemplo, la señalización transmembrana redox activa NFkB en los macrófagos y linfocitos (Gin-Pease y Uhisler 1998; Haul et al. 1998). El factor nuclear kappa B proteínas (NFkB)] son dimétricos, los factores específicos de secuencia de transcripción implicados en la activación de un número excepcionalmente elevado de genes en respuesta a la inflamación, viral, e infecciones bacterianas y otras situaciones de estrés que requieren una rápida reprogramación de la expresión génica.

Los resultados previos han demostrado que tratamiento de clinoptilolita en los ratones y perros de diversos tipos de tumores condujo a una mejoría del estado de salud general, prolongada vida útil, y la disminución del tamaño del tumor (Pavelic et al., 2001). Además, los estudios de toxicología en ratas y ratones demostrado que el mismo tratamiento que no tenía ningún efecto negativo (Pavelic et al. 2001). In vitro de cultivo de tejidos estudios mostraron que finamente molido clinoptilolite inhibe la proteína quinasa B (c-Akt), expresión inducida de p21UAF1] CIP1 y proteínas presaras p27HIP1 tumorales SUP-, y la disminución de la proliferación celular en varias líneas celulares de cáncer. Aquí presentamos evidencia para la actividad antimetastásica y inmunoestimulador efecto de clinoptilolita en vivo. Además, se propone un posible mecanismo de su acción. 

 

MATERIALES Y MÉTODOS

Clinoptilolita natural

El polvo fino de clinoptilolitas naturales (MZ “micronizado zeolita) de Eslovaquia se obtuvo por tribomecanica micronización. curvas de distribución de tamaño de partícula de la MZ fueron tomadas por un Mastersize YLB (Malvern) dispersión de luz láser de tamaño de partícula analizada. clinoptilolita natural tratado Tribomecanicamente contenía aproximadamente 80% en peso de clinoptilolita. El 20% ley consistieron con- restante de la sílice, montmorollonita, y zeolita mordenita. Composición química de clinoptilolita “SiO2 70,06%, Al2O3 12,32%, Fe2O3 1,48%, CaO 3,42% MgO 0,96%, TiO2 0,71%, P2O5 0,05%, MnO 0,02%, Na2O 0,68%, H2O 2,38%, SO3 0,17%, y H2O 7,3%. Humedad a 105 ° C fue max. 6%, pH 6.9 a 7.1, la masa 2,39 g] cm3 específica, área específica 360-390 m2] g, + sustitución NH capacidad de 8500 mg NH +] kg. Tamaño de partícula y para la medición de la respuesta inmune celular. 

Animales

C57Bl] 6 ratones se utilizaron para el experimento con B16 metástasis. ratones CBA] HZ gr y RFM se utilizaron para parámetro para la respuesta inmune celular Los ratones tenían aproximadamente 3 meses de edad y entre 21-26 gr de peso. Los ratones fueron criados en el instituto de animales RUDER. Se les dio comida y agua del grifo y libitum. Los animales se mantuvieron en circunstancias convencionales, ritmos claros / oscuros 12/12 h, temperatura 22 c y humedad 55 %.

Aplicación de MZ

Desde MZ es insoluble, se administró a los ratones por vía oral por sonda (100 mg] ratones por día) o en su dieta dado como alimento estándar que consiste en 12,5% o 25% MZ. Cada ratón se comió aproximadamente 4 g de cada día, consumiendo así 0,5 g o 1 g MZ, respectivamente. En parte de los experimentos suspensión de MZ se administró intraperitonealmente (3 mg ratón]).

Evaluación de antimetastásica erecta del MZ

Diez ratones (C57BL] 6) se inyectaron i.v. con 7,5 × 104 células de melanoma B16. Durante los siguientes 16 días, que fueron tratados diariamente con MZ (100 mg] ml H2O por ratón destilada) por intubación gástrica. controles CON- (6 ratones) fueron intubados diario con H2O destilada. Los ratones se mataron, y los pulmones se retiraron y se fijaron en Bouen. Las metástasis fueron contadas y el análisis estadístico se realizó mediante la prueba t de estudiante.

Aislamiento de macrófagos peritoneales

Los macrófagos peritoneales se recogieron asépticamente de las cavidades peritoneal peri de ratones 24 horas después de i.p. o 7, 14, 21, y 28 días después por administración OS de MZ. Los macrófagos se recogieron con solución de Hank (sin rojo fenol, Sigma) y las células rojas de la sangre fueron eliminados por NH4Cl lisis. Las células restantes se lavaron tres veces, se suspendieron en RPMI 1640 (sin rojo fenol, Sigma) suplementado con antibióticos y 10% de suero de ternera fetal (FCS; Sigma), y se ajustaron a 2 x 106 células] ml.

Ensayo para la liberación de anión superóxido (O2-)

En los macrófagos, la liberación de superóxido se midió como (SOD) reducción inhibirse de superóxido dismutasa de ferricitocromo C utilizando una modificación del método de Johnston et al. (Johnston et al. 1978). Las muestras contenían 1 ml de citocromo C (1 mg] ml) en solución salina equilibrada de Hank libre de fenol y 2 x 106 células en 100 l de medio. La especificidad de la reacción se analizó mediante las adiciones de 60 IU SOD por mililitro de la mezcla de reacción. La actividad re- de las células se ensayó mediante la adición de citocromo C en solución libre de fenol de Hank durante 30 min a 37 ° C. Después de la incubación, la mezcla de reacción se centrifugó durante 5 min a 800 x g, y se determinó la absorbancia del sobrenadante espectrofotométrica a 550 nm. La concentración de la reducción de citocromo C se calculó usando la fórmula E550nm = 2,1 x 104 M-1 cm-1.

Las reacciones locales alogénicas contra el huésped

Una versión modificada descrito por LYGVHR Shohat y Trainin (Shohat y Trainin 1980). En nuestro experimento, LAG- VHR se realizó en ratones alogénico en lugar de ratas. Para cada perímetro diez ratones ex de control (tratados con alimentos convencionales) y diez ratones de cada grupo experimental fueron utilizados. Se alimentaron ratones CBA o bien 12,5% (0,25 g) o 25% (0,5 g) MZ por día, durante un período de 21 o 28 días. Los ratones fueron sacrificados por sangrado. La piscina de linfocito de ganglios linfáticos de 3-5 tratados o ratones de control se preparó, se lavó dos veces con Hank de por centrifugación. Se inyectaron 2 x 107 células vivas por vía intradérmica en la piel abdominal afeitada de ratones RFM (irradiado con 7 Gy, 24 h antes), donde los linfocitos provocaron la reacción GVH y el daño de la piel. En el día 5, se inyectaron los ratones tratados por vía intravenosa con 0,4 ml de 0,5% azul de Evans. Cinco horas más tarde toda la piel abdominal se cortó y el área teñida de azul se midió con el calibrador a lo largo de dos diámetros opuestos. Un diámetro medio de cada punto se muestra como un resultado.

Activación NFkB en el bazo

Veinticuatro horas después de la inyección i.p. de MZ a ratones experimentales, y solución de Hank con ratones de control, los animales se sacrificaron por dislocación Vical CER. Para la preparación de citoplasma y fracciones nucleares de bazo, se aislaron células y se hizo un extracto de bazo crudo. Los eritrocitos se eliminaron mediante lisis de cloruro de amonio. El procedimiento de fraccionamiento nuclear y citosólico fue una modificación del protocolo de Lernbecher et al. (Lernbacher et al. 1993). Las células se lavaron dos veces con solución salina buRered-fosfato sin calcio y magnesio y se suspendieron en Bufer (HEPES 10 mM, pH 7,9, MgCl2 1,5 mM, HCl 10 mM, PMSF 0,5 mM).

Después de la lisis de 60 min en hielo, los núcleos se centrifugaron, y el de sobrenadante, después de la centrifugación adicional a 17500 x g, se guardó como la fracción citoplásmica. El sedimento nuclear se suspendió en Bufer C (HEPES 20 mM, pH 7,9, 0,42 M NaCl, MgCl2 1,5 mM, mM EDTA 0,2 mM, PMSF 0,5, 25% de glicerol), agitó en vórtex, y incubado en hielo durante 45 min. La centrifugación a 17.500 × g se per- formado para eliminar los residuos insolubles. El sobrenadante se utilizó como extracto nuclear.

Western blot (inmunoblot) análisis

La concentración de proteína en las fracciones nucleares y el citoplasma se determinado por el ensayo de Bradford. Igual cantidad de proteínas de plasma nucleares y citoplasma (20 mg y 80 mg, respectivamente) fueron separados por 9% - SDS PAGE y se transfirieron a una membrana de PVDF (Immobilon-P, Millipore). Los niveles de proteínas cargadas fueron verificados por Ponceau S y Commassie coloracion azul. Las membranas se bloquearon durante la noche con TBS] 2,5% de BSA a 4 ° C. 

Después de eso, se incubaron durante 90 min con anticuerpos primarios (anti-p50, anti RelB, y anti-p65), se lavó en TBS] 0.05% Triton Y-100, y después se incubaron durante 1 h con el anticuerpo secundario apropiado. Siguiendo lavados adicionales, las inmunotransferencias se visualizaron usando el reactivo de quimioluminiscencia potenciada (POD; Boehringer-Mannheim, Alemania). Para las inmunotransferencias, se utilizaron anticuerpos policlonales contra p50 y RelB (Santa Cruz, EE.UU.) y anticuerpo monoclonal contra p65 (Transduction Laboratories, USA). cuerpos anti secundarios fueron peróxido de conjugado de conejo anti-ratón inmunoglobina (Amersham] Pharmacia, Suecia) y la proteína de peróxido de conjugado A desde Hierkegaard y Perry Laboratories.

RESULTADOS

Antimetastásica erecta del MZ

En el experimento en el que se inyectaron 15 × 104 células de melanoma en los controles y los ratones tratados con MZ, el número de metástasis de pulmón se redujo de 36,05 ± 13,09 (en el grupo de control que consta de seis ratones) a 21,0 ± 4,96 para los ratones tratados (que consiste en cinco animales). Esto no fue estadísticamente significativo (P = 0,056). Por otro lado, si se inyectaron 7,5 x 104 células de melanoma, los ratones (diez animales) MZ-tratada tenía un número reducido de metástasis de pulmón en comparación con los controles (cinco animales). Mientras el número de metástasis en el grupo control fue de 5,2 ± 1,64, en los ratones tratados con el número de metástasis se redujo fuertemente a 0,7 ± 1,06. En DICIÓN ad-, la significación estadística fue p <0,001.

Influencia de MZ en los macrófagos O - producción, la peroxidación lipídica (LPO) en el hígado, y el ácido siálico lípido unido (LSA) en el suero de ratones sanos alimentados con MZ.

La producción de O2, TBARS, y la concentración LSA se midieron en ratones sanos alimentados con MZ (0,5 g o 1 g día]) durante 7, 14, 21, y 28 días. Los resultados se muestran en la Tabla 1. La concentración de O2 (en los macrófagos peritoneales) empezaron a cambiar ligeramente de 14 días después de administrar de 1 g de MZ. Sin embargo, la concentración de TBARS (en el hígado) comenzó a cambiar significativamente 21 días después de la administración, independientemente de la concentración de MZ. Resultados significativos en cuanto a la concentración relativa LSA en el suero se obtuvo con 1 g MZ en el día 28.  

Efecto de la MZ en el injerto alogénico local versus la reacción del huésped

Los resultados de dos experimentos preparadas por separado en ratones sanos alimentados MZ 21 y 28 días se muestran en la Fig. 1. Las células de los ganglios linfáticos de los ratones alimentados con 28 días con MZ (1 g] día) provocaron una significativamente mayor reacción GVH que las células de los ratones del grupo de control. Un tratamiento con una dosis más baja (0,5 g) de MZ durante 21 o 28 días también muestran en el control del grupo, pero no fue significativo. 

Efecto de la administración de i.p. de MZ en el número de macrófagos de ROIs de la generación y los parámetros de estrés oxidativo (OS)

La administración intraperitoneal de MZ a una dosis superior a 3 mg fue letal para ratones y una dosis de 3 MS fue subletal pero proinflamatoria. En experimentos una producción de dosis de O2 y NO, así como en la medición de la TSA en el bazo y la concentración de TBARS en hígados fue preformada 25 h después de la inyección intraperitoneal de MZ. 

MZ provocó la acumulación de macrófagos en el peritoneo. el número de macrófagos (PM) peritoneal después del tratamiento fue siete veces más alto bronceado en ratones de control. la concentración de O2 fue de diez veces mayor en los macrófagos de los ratones tratados que en los controles. Desde O2 - liberación se calculó a 10 células, el aumento de la liberación no era el resultado de un mayor número de macrófagos, pero representa verdaderamente aumento de la actividad. La producción de NO por los macrófagos peritoneales aislados de ratones tratados, y se cultivaron durante otras 24 h ex vivo, disminuyeron fuertemente. No hubo ningún cambio en las concentraciones de TBARS hígado (expresada en nmol] mg de proteína) entre el control óxido entre el grupo de control y el grupo tratado. Además, la concentración de TSA no fue cambiada después del tratante de con MZ. nítrico. 

Eso dio lugar a un crecimiento días aumento de la concentración LSA en suero en ratones sanos, lo que probablemente se asocia con el proceso inflamatorio, es decir, la activación de los macrófagos. Eso se con- confirmado por nuestros datos de O elevado - en rophages MAC-peritoneales de ratones alimentados-MZ. sospechoso Ue, de acuerdo con los resultados anteriores (Sydow et al. 1989), que los factores acti- vating e influir en la proliferación o el aumento de la capacidad de síntesis del sistema de fagocito podría causar un cambio en el nivel de LSA suero. También es posible que los macrófagos participan en este proceso indirectamente por la liberación de TNF-a y la interleucina-1 o está conectado con una elevación de proteínas de fase aguda.

Efecto inmunoestimulante de MZ en vivo

A pesar de una vía parenteral de aplicación no es adecuada, para confirmar el efecto inmunomodulador de MZ se examinaron los procesos que ocurrieron después de la aplicación intraperitoneal MZ. Para este fin, se inyectaron cantidades diferentes de MZ en ratones normales y saludables. Se demostró que erecto de MZ era dependiente de la dosis. Dosis superiores a 3 mg ratón] eran tóxicos. Sin embargo, ya que las dosis más bajas (3 mg] ratón) tenían un erecto inflamatoria no tóxico, pero proinflamatorio, se midieron los parámetros inmunológicos. En la fase aguda del proceso proinflamatorio, un gran número de leucocitos polimorfonucleares (PMNs) migran desde la sangre y se acumulan en el exudado (Hambleton y Miller 1989). En nuestros experimentos, 24 h después de la administración MZ, se encontró una alta acumulación de los macrófagos en el peritoneo de los animales tratados.

Normalmente, NO reacciona con O2 - en una reacción bastante rápido, que se completa en menos de 1 microsegundo (Huie y Padmaja 1993). Por lo tanto, cualquier NO producido en condiciones aerobias se convierte rápidamente en anión peroxinitrito. anión peroxinitrito es un oxidante fuerte con la actividad tericidal BAC-. A pH fisiológico que se protóna para formar ácido peroxinitrito, a, oxidante fuerte vida relativamente larga, lo que podría iniciar la oxidación de los lípidos. Estas reacciones podrían explicar el tóxico (en dosis más altas) e inflamatoria (en dosis más bajas) erecto de MZ administrado en peritoneo. Además, el agotamiento se muestra de NO de macrófagos peritoneales podría haber aumentado significativamente la generación de superóxido y de esta manera podría haber intensificado el efecto de MZ. Puesto que la concentración de TBARS en el hígado y TSA en el bazo de ratones tratados sigue siendo el mismo.

La fagocitosis per se o especies reactivas de oxígeno (ROS) pueden estimular los macrófagos para secretar TNF-a y otras citoquinas que normalmente estimular inmunológica res- puesta (Chaudhri y Clark 1989). Un factor de transcripción ubicuo de particular importancia en las respuestas inmunes e inflamatorias es factor nuclear kappa B (NFnB) (Hopp y Ghosh 1995). Por lo tanto, hemos querido examinar la activación de NFkB en esplenocitos de ratones tratados con MZ. Nuestros resultados mostraron translocación inducida por MZ de p65 en el núcleo de las células esplénicas de ratón de RFM. Este hallazgo sugiere que MZ actúa como un inmunoactivador NFkB, y por lo tanto inducir la transcripción de genes regulados con NFkB.

Una cantidad disminuida de p50 y una mayor cantidad de proteínas RelB en los ratones tratados en comparación con los ratones de control podría ser debido a un número cambiado y] o relación de B y T linfocitos. El hecho de que los bazos de los ratones tratados eran 11% más pesados ​​contribuye a esta suposición. Linfocitos B tienen un nivel basal de homodímero de p50 que no es inducible por estimulación (Liou et al. 1994) y] o sirven como reguladores de la actividad NFkB (se bloquea et al. 1992). Una cantidad total disminuida de la proteína p50, así como la translocación sin cambios en el núcleo, podría implicar que los linfocitos B no se estimularon por MZ. En DICIÓN ad-, RelB] heterodímero p50 es constitutivamente activa en células linfoides primarios y su presencia se correlaciona con la expresión de transgenes específicos linfoides constitutiva de genes implicados en B- y el desarrollo de células T (Lernbecher et al 1993. Lernbecher et al. 1994). Esto explica nuestra conclusión de que el tratamiento MZ no tenía ningún (o sólo tenía una ligera) erguido sobre la translocación de la subunidad RelB en el núcleo de las células del bazo de ratones RFM. Estos hechos también explican una cantidad relativamente alta basal de las proteínas p50 y RelB en núcleos de esplenocitos de control.

Mientras linfocitos B y varias otras células exhiben tanto constitutiva y se estimularon activación NFkB, única actividad NFkB inducible se ha descrito en células T o líneas de células T (Schreck et al. 1991). Sin embargo, la activación de células T como completa requiere al menos dos señales proporcionadas por el receptor de células T (TCR) y otra molécula de reglamentación de estimulación óptima activación NFkB en la célula T es también dependiente de los mecanismos duales de señalización (Crabtree y Clipstone 1994). Muchos agentes han demostrado promover la activación de NFnB en células T, incluyendo TNF-a (Menon et al. 1995), ionóforos de calcio (Ginn-Pease y Uhisler 1998) y H2O2 (Schreck et al. 1991). Sin embargo, la activación máxima NFnB se ha observado en respuesta a las combinaciones de los estimulantes que cumplan los requisitos duales de señalización de células T (Crabtree y Clipstone 1994; Hanno y Siebenlist 1996). ROS se han encontrado para actuar como segundos mensajeros en la activación de las proteínas NFkB] Rel (Schreck et al. 1991) y el estrés oxidativo puede modular la actividad de NFkB en células T (Ginn-Pease y Uhisler 1998). Además, los resultados previos han demostrado que NFkB se activa en las enfermedades inflamatoria. Por lo tanto, de acuerdo con todos estos resultados, así como a la nuestra, llegamos a la conclusión de que MZ, en nuestros experimentos, posible mecanismo de MZ en la acción in vivo.

Posible mecanismo de MZ en la acción de vivos

Debido a nuestros resultados, proponemos el mecanismo de acción de MZ en vivo. MZ causó inflamación local en el lugar de aplicación que atrajo macrófagos peritoneales. Los macrófagos se activan, que se ha demostrado con el aumento de O2 - producción. Sugerimos que los macrófagos activados producen TNF-a que, junto con los otros estimulantes (por ejemplo, otras citoquinas, ROS o la concentración de calcio cambiado), estimularon células T de bazo. Dado que los productos de los genes que son regulados por NFkB también causan su activación, este tipo de bucle regulador positivo puede amplificar y perpetuar la respuesta inflamatoria local. Nuestra hipótesis es que MZ actuó de la misma manera después de la administración por vía oral, afecta intestinos macrófagos. Los resultados de los experimentos con la reducción de las metástasis, cuando se inyecta un menor número de células tumorales, así como injerto alogeneica locales frente a reacción del huésped, puede confirmar parcialmente esta hipótesis. Nuestros resultados están de acuerdo con la evidencia acumulada de que las zeolitas podrían desempeñar un papel importante en la regulación del sistema inmune, así como con el informe de que la sílice, silicatos y aluminosilicatos actúan como inmunomoduladores no específicos de manera similar a superantígenos.

Para confirmar adicionalmente la hipótesis, TNF-a en el suero y B y los linfocitos T deben medirse por separado, así como la activación de NFkB en macrófagos.

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