Clinoptilolita / PCL-PEG-PCL andamios compuestos para aplicaciones de ingeniería de tejido óseo

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RESUMEN

El objetivo de este estudio fue para preparar y caracterizar altamente poroso clinoptilolita / poli ( mi- caprolactona) poli (etilenglicol) -poli ( mi- caprolactona) andamios compuestos. Los andamios con diferentes contenidos de clinoptilolita (10% y 20%) se fabricaron con el polvo de la técnica de lixiviación de compresión / partículas libre de disolvente reproducible. Los andamios tenían porosidad interconectiva en el rango de 55-76%. Clinoptilolita / poli ( mi- caprolactona) -poli (etilenglicol) poli ( mi- caprolactona) andamios mostraron una degradación insignificante dentro de las ocho semanas y se muestran menos absorción de agua y una mayor bioactividad de poli ( mi- caprolactona) -poli (etilenglicol) -poli ( mi- caprolactona) andamios. La presencia de clinoptilolita mejoró las propiedades mecánicas. Alta resistencia a la compresión (5,6 MPa) y el módulo (114,84 MPa) se alcanzaron con el grupo de andamio que contiene 20% de clinoptilolita. En capacidad de adsorción de proteínas in vitro de los andamios fue también más alta para clinoptilolita / poli ( mi- caprolactona) -poli (etilenglicol) -poli ( mi- caprolactona) andamios. Estos andamios tenían proteína 0,95 mg / g capacidad de adsorción de andamio y también mayor osteoinductividad en términos de ALP mejorada, actividades OSP y la deposición de calcio intracelular. Estequiométrico deposición de apatita (Ca / P ¼ 1,686) se observó durante el análisis de proliferación celular con células osteoblastos fetales humanos.

Por lo tanto, se puede sugerir que clinoptilolita / poli ( mi- caprolactona) poli (etilenglicol) -poli ( mi- caprolactona) andamios compuestos podrían ser portadores prometedores para la mejora de la regeneración ósea en aplicaciones de ingeniería de tejidos óseos.

INTRODUCCION

El tratamiento de grandes defectos es una de las cuestiones más dif'ıcil en ingeniería de tejido óseo. Aunque la estructura ósea es sti ff contra impacto y dúctil bajo estrés, en algunos casos, el hueso puede enfrentar una fuerza excesiva o carga cíclica lo que provocaría un fallo estructural. Reposición completa no puede ocurrir en daños de hueso que causa la pérdida de tejido óseo por encima de tamaño crítico como el resultado de la cirugía, anomalías esqueléticas congénitas, o resecciones tumorales. 

En consecuencia, los daños óseos pobres o no cicatrizadas pueden causar dolor crónico y degeneración prolongada en el hueso y los tejidos circundantes. ingeniería de tejido óseo o FF ers un enfoque alternativo a los tratamientos tradicionales utilizando edad sca ff preferentemente biomiméticos. Se espera que el tejido óseo edad sca FF para ser biocompatible, biodegradable, y mecánicamente estable durante la regeneración de tejido óseo.

Por otra parte, las propiedades tales como alta porosidad y la regeneración de tejidos de adaptación de velocidad de degradación Tailormade tasa son importantes para la colonización celular, usion nutriente di ff, y fi c matriz extracelular deposición de hueso-específico para permitir la osteogénesis. polímeros sintéticos biodegradables tales como poli (láctico-co-ácido glicólico) (PLGA), poli (ácido láctico) (PLA), poli ( mi- caprolactona) (PCL), y poli (etilenglicol) (PEG) se han utilizado con frecuencia como materiales antiguos sca hueso ff debido a su biocompatibilidad, productos de degradación no citotóxicas, y las tasas de degradación fácilmente adaptados. PCL es un polímero sintético aprobado por la FDA que es ampliamente utilizado en construcciones de tejido óseo. PCL tiene un alto grado de cristalinidad y la hidrofobicidad que extiende su tiempo de degradación in vivo hasta 3-4 años. Esta lenta degradación también puede hacer que el polímero no preferible como un material de matriz desde regeneración del tejido óseo en el sitio podría s r ciente FFI ine con edad ff PCL SCA. Con el fin de abordar esta inconveniencia, PCL mezclas con polímeros funcionales hidrófilos y que degradan rápidamente o PCL sca compuesto edad ff con moléculas bioactivas han sido ampliamente utilizados en la ingeniería de tejido óseo. 

En los últimos años, el PEG fue aprobado por la Food and Drug Administration de Estados Unidos (FDA) para el uso interno en investigación y aplicaciones biomédicas. Se ha utilizado en construcciones de tejido de hueso para aumentar la hidrofilia y la degradabilidad de los niños de sca ff  así como para mejorar la unión celular, la orientación, y la biocompatibilidad.  Varios copolímeros de bloque de PEG con PCL se han usado para aplicaciones biomédicas di ff Erent. copolímeros de PEG-PCL son biodegradables y biocompatibles y que han sido ampliamente investigado como sca ff material antiguo para ingeniería de tejido óseo. copolímeros de PEG-PCL se pueden sintetizar mediante el uso de método de polimerización con apertura de anillo y copolímeros con diferentes termoplasticidad, degradabilidad y la hidrofilia se pueden obtener cambiando la proporción de PCL-PEG. PCL-PEG-PCL (PCEC) también han sido ampliamente usado para preparar edad sca ff para ingeniería de tejido óseo debido a su capacidad para formar mezclas, materiales compuestos, y la capacidad de incorporar moléculas bioactivas sin dañar sus actividades biológicas.

Clinoptilolita (CLN) es una zeolita natural biocompatible hecha de columna vertebral de aluminosilicato unido iónicamente al sodio, calcio, potasio, y los iones de magnesio. En un estudio previo, a ácido y de base tratados con muestras naturales CLN con di ff Erent relación Si / Al mostraron una muy alta capacidad de adsorción para la albúmina de suero bovino (BSA), y un aumento significativo en la cantidad de BSA adsorbido se observó para el ácido - y la base tratada con muestras CLN. En este estudio, se planteó la hipótesis de que altamente porosas CLN-PCEC edad SCA compuesto ff con buena interconectividad de los poros pueden actuar como portador osteoinductora para aplicaciones de ingeniería de tejido óseo. Aquí, una zeolita natural, CLN, se utilizó en la preparación de edad sca ff para proporcionar la adsorción de proteínas y fomentar la formación de hueso nuevo, mientras que el aumento de la resistencia mecánica y la bioactividad de los niños de ff copolímero de SCA.

Porosos PCEC compuesto y puro edad sca ff CLN-PCEC se prepararon usando técnica de compresión de polvo seguido de sal (NaHCO 3) método de lixiviación de partículas. copolímero tribloque PCEC fue sintetizado por copolímero de polimerización y tribloque de apertura de anillo se caracterizó por escaneo diferencial di ff calorimetría de barrido (DSC), análisis termogravimétrico (TGA), nuclear de protones resonancia magnetica ( 1 H RMN), y espectroscopía infrarroja por transformada de fourier (FT-IR). El e ff ect de contenido CLN en las propiedades sca ff viejos tales como la morfología, la porosidad, mecánico, in vitro bioactividad, degradación, y propiedades de absorción de agua se investigó. Protein capacidad de adsorción de edad ff sca También se examinó incubando CLN-PCEC compuesto y edad ff PCEC sca puros en solución de suero bovino fetal (FBS). Además, la proliferación y osteoblástica di erentiation ff de las células en los niños de ff sca se evaluaron con in vitro estudios de cultivo celular. Es el tiempo primero que CLN-PCEC edad sca ff se prepararon y analizaron para aplicaciones de ingeniería de tejido óseo.

MATERIALES Y METODOS

MATERIALES

PEG (M norte: 4000 kDa), mi- caprolactona (puro, 97%), sin esquilar ADN de timo de ternera, bicarbonato de sodio (NaHCO 3), cloruro de calcio dihidrato (CaCl 2. 2H 2 O), o-cresophtalein, ácido 8-hidroxiquinona-5-sulfónico, y 2-amino-2-metil 1,3-propanodiol se adquirieron de Sigma-Aldrich (MO, EE.UU.). dilaurato de dibutilestaño (DBTDL) se obtuvo de Merck (NJ, EE.UU.). dodecil sulfato de sodio se adquirió de Biorad (CA, EE.UU.), Prestoblue de Invitrogen (MA, EE.UU.), kit alcalina análisis de la fosfatasa y kit de análisis de osteopontina de Abcam (Cambridge, UK). Todos los otros productos químicos utilizados en el estudio fueron de grado reactivo y se utilizan como comprado.

Síntesis y caracterización de copolímero tribloque PCEC copolímero tribloque PCEC se sintetizó mediante polimerización por apertura de anillo de mi- caprolactona ( mi- CL) iniciado por PEG en presencia de dilaurato de dibutilestaño como catalizador. 28 Brevemente, el PEG se introdujo en una de tres bocas matraz en un baño de vaselina líquida y se mantiene en 100 C durante 30 min bajo N 2 ambiente para eliminar la humedad. Entonces, mi- CL con (PEG / mi- CL 1:24 (w / w)) alimentar relación y dilaurato de dibutilestaño con una concentración de se añadieron 0,5% de total de reactantes y la mezcla se agitó a 140 C durante 24 h bajo N 2 atmósfera. Después de enfriar a temperatura ambiente, el copolímero tribloque resultante se disolvió en diclorometano y se precipitó mediante la adición de exceso de cantidad de etanol para eliminar el catalizador y residual mi- CL. El precipitado se filtró a continuación, FI, se lavó con etanol varias veces, y se secó a 40 C en horno de vacío durante tres días.

Las composiciones químicas de PEG y homopolímeros PCL y copolímero de tres bloques PCEC se estudiaron con transformada de Fourier espectroscopia de infrarrojos (FT-IR) (Bruker IFS 66 / S, FRA 106 / S, Karlsruhe, Alemania) y resonancia magnética nuclear protónica ( 1 H RMN) (Bruker Biospin, Rheinstetten, Alemania). El peso molecular promedio en número (M norte) de copolímero se determinó por 1 análisis H RMN. El cálculo de M norte valor, el grado de polimerización, y PCL relación / PEG de copolímero tribloque sintetizados se basan en la relación de integridad de la 1 picos H RMN a 4,07 ppm que pertenece a los protones de metileno (-CH 2 -) de segmento de PCL y 3,65 ppm (-CH 2 -) que pertenecen a segmentos de PEG. Las ecuaciones (1) a (3) se utilizaron en los cálculos como se indica a continuación donde 44 (g / mol) y 114 (g / mol) corresponden a los pesos moleculares de etilenglicol (EG) y caprolactona linealizado (CL), respectivamente. 32 DP muestra el grado de polimerización para cada uno del homopolímero y se utiliza para detectar el peso molecular promedio en número de PCEC (M nPCEC).

Además, las propiedades térmicas de PCL, homopolímeros de PEG, y copolímero de PCEC se determinaron mediante el uso de análisis termogravimétrico (TGA, Perkin Elmer, Waltham, MA, EE.UU.) y di ff calorimetría de barrido diferencial (DSC, Perkin Elmer, Waltham, Massachusetts, EE.UU.). Temperatura de descomposición (T re) se determinó por TGA, y temperatura de fusión (T metro), temperatura de cristalización (T do), entalpía de fusión ( H), y el porcentaje de cristalinidad (X do) de PEG, homopolímeros de PCL, y copolímero tribloque PCEC se determinaron por DSC. X do del copolímero de tres bloques homopolímeros y PCEC se calcularon utilizando el M norte valores de PCL, homopolímeros de PEG, y copolímero de PCEC obtuvieron a partir de 1 H espectros de RMN como se da en las ecuaciones (4) a (6) donde H 1m representa entalpía experimental de fusión de PCEC mientras H 2m muestra entalpía teórica de fusión de PCL 100% cristalino y homopolímeros de PEG. METRO nPCL, METRO nPEG y M nPCEC representan H norte valores evaluados de la relación de integridad de la 1 H RMN picos para cada copolímero homopolímero y tribloque.

Caracterización de CLN morfología de la superficie y químico composicion de CLN. morfología de la superficie y la composición química de CLN se determinaron mediante el uso de microscopía electrónica de barrido de electrones (SEM, JSM-6400, JEOL, Tokio, Japón) y análisis de espectroscopia de energía dispersiva de rayos X (EDS) equipado con SEM, respectivamente. tamaño de partícula y potencial zeta de CLN. La distribución de tamaño de tamaño medio de partícula y partícula de CLN se determinaron mediante dispersión en húmedo en agua desionizada (dH 2 O) sin el uso de cualquier tensioactivo (DLS, Malvern CGS-3, Langen, Alemania). dispersidad del tamaño de partícula (SPAN) se calculó por la ecuación (7) donde d [0,9], d [0,5], y D [0,1] representan 90 o, 50a, y percentiles 10, respectivamente Anterior a la fabricación de edad sca ff, CLN se separó por filtración a través de un 50 metro m de malla, se desgasificó a vacío a 100 estabilidad C. electrostática de CLN a diversos valores de pH se determinó con un potencial zeta ( F) análisis dentro del rango de pH de 2 a 11 (Malvern Nano ZS90, UK).

La adsorción de proteínas en CLN. Se empleó el método de lotes de equilibrado clásico para medir la capacidad de adsorción de proteína de la CLN cuantitativamente. Se añadieron cincuenta miligramos de CLN hasta 10 ml solución de BSA (BSA 10 mg en 10 ml de 0,1 M fosfato bu ff solución salina Ered, PBS) de diferentes fuerzas iónicas (0,05, 0,1, y NaCl 0,15 M en agua) y agitada magnéticamente. Después de eso, la solución se centrifugó a 15.000 r / min para recoger el sobrenadante que contiene no adsorbida BSA. El contenido de proteína en el sobrenadante se midió mediante el uso de ácido bicinconínico micro ( metro BCA) ensayo. El sobrenadante se añadió en BCA solución que contiene 50 partes de BCA y 1 parte de sulfato de cobre pentahidratado (4%) y luego trabajar la densidad óptica a 562 nm se midió con un lector de microplacas ( metro Quant, BioTek , Winooski, VT, EE.UU.). La cantidad de BSA adsorbida en el CLN se calculó por la ecuación (8) donde q mi representa la cantidad de la BSA adsorbida por CLN en mg BSA / g CLN, C yo es la concentración inicial de BSA, C mi es la concentración de BSA en el sobrenadante, V es el volumen de solución de BSA (L), y m es el peso de la CLN (g).

PEPARACION Y CARACTERIZACION DE LOS ANDAMIOS COMPUESTOS

Preparación de andamios. De alta porosidad de CLN-PCEC sca compuesto edad ff se produjeron a través de compresión de polvo seguido de lavado de partículas (Figura 1). Brevemente, la cantidad pre-determinada de copolímero PCEC se pulverizó en etanol absoluto mezclando a 2000 r / min durante una hora (T25 Ultra-Turrax, IKA, China). Entonces, el polvo de copolímero se secó durante la noche en horno atmosférico se tamizó a través de 50 metro m engrana junto con CLN y porógeno (NaHCO 3). Con el fin de producir una mezcla homogénea, los componentes se mezclaron en etanol absoluto bajo 1000 r / min durante 10 min. A continuación, la mezcla se vertió en una placa de Petri de vidrio y parcialmente se seca para formar una suspensión para evitar la sedimentación de CLN y NaHCO 3 durante el secado. Para eliminar el etanol, la mezcla se secó en horno atmosférica durante 24 h. Después de eso, la mezcla en polvo se puso en molde de acero inoxidable (13 mm de diámetro) acondicionado a 50 C y comprimido bajo 250 MPa entre la relajación apoya durante 3 min usando frío prensa de pistón (Carver AutoPellet Press, IN, EE.UU.). Las cantidades de los componentes viejos sca FF y di ff Erent polímero-a-NaHCO 3 y polímero-a-CLN relaciones usados en la vieja preparación sca ff se dan en la Tabla 1. Fabricado edad ff sca estaban en forma de disco con un diámetro de 13 mm y una altura de 4 mm.

Los niños de fsca no poroso preparadas fueron luego puestos en dH 2 O para eliminar NaHCO 3 para obtener la porosidad. En ciertos intervalos de tiempo, el agua se refrescó y se midió el pH del agua. Un valor de pH de 7 se consideró como la indicación de que NaHCO 3 lixiviado de los andamios. Los niños de ff sca obtenidos se secaron y se almacenaron a 4 C en un desecador hasta su uso. Como grupos de control, puro PCEC edad sca ff también se prepararon usando el mismo método. Determinación de la reproducibilidad de la técnica. método de fabricación sin disolventes de edad ff sca se ensayó para determinar su reproducibilidad mediante la determinación de la rencia di ff entre los pesos de los niños de sca ff preparados en lotes Erent di ff ( norte ¼ 7; dos conjuntos di ff Erent en distintos periodos de tiempo) y M norte valor de copolímero ( norte ¼ 2) antes y después de la preparación. El cambio en los pesos de la edad sca ff antes y después de NaHCO 3 lixiviación se calculógravimétricamente como el cambio porcentual usando la ecuación (9)

El cambio en el M norte valor del copolímero antes y después de edad preparación sca ff se examinó mediante el uso de 1 espectroscopia H RMN. Además, el contenido de CLN de edad ff sca se determinó utilizando TGA a una velocidad de calentamiento de 10 C / min entre 30 C y 600 C. Para todas las pruebas, olds ff PCEC sca porosos puras se utilizan como grupos de control. morfología andamio. La morfología de la superficie de edad ff CLNPCEC sca se examinó por SEM (NanoSEM 430, FEI, OR, EE.UU.). edad ff Sca se montaron en los trozos de metal con cinta de carbono y de vacío recubierto de oro (25 nm) mediante el uso de Hummle VII dispositivo de revestimiento por bombardeo iónico (Anatech, Alexandria, VA, EE.UU.) antes del análisis SEM. Medición de la porosidad. La porosidad de los niños de ff sca se midió utilizando el principio de Arquímedes aplicando el método de desplazamiento de líquido a temperatura ambiente. 37

Una botella densidad se llenan con etanol absoluto como el desplazamiento de líquido a 25 C ya que es no disolvente para el copolímero PCEC. Brevemente, olds ff sca se sumergieron en etanol absoluto con un volumen predeterminado de V 1 y se aplicó el protocolo de presurización-despresurización cíclica para forzar etanol para moverse en los poros. El volumen total de etanol y completamente hundido viejo sca ff se indican como V 2. Después se retiró el ff sca viejo saturado con etanol, el volumen residual (V 3) fue medido. Porosidad abierta ( mi) valores de los niños de ff sca se calcularon utilizando la ecuación (10) In vitro degradación y la absorción de agua. estudio de degradación para CLN-PCEC y edad ff PCEC sca puras se llevó a cabo en solución 10 ml PBS (0,01 M, pH 7,4) en un baño de agua con agitación a 37 C durante ocho semanas ( norte ¼ 3). solución PBS se renovó cada dos días. Se evaluó el cambio porcentual en el peso de los niños de sca ff después de períodos de incubación di ff Erent utilizando la ecuación (11) donde M yo y M F representar el peso de los niños de sca ff antes y después de Erent di ff períodos de incubación, respectivamente. El comportamiento de absorción de agua de los niños de sca ff a intervalos específicos c tiempo (1, 3, 6, 24, 48, 72, 96 y 120 h) se estudió en solución de 10 ml de PBS ( norte ¼ 3). La relación de absorción por ciento de agua de los niños de ff sca se calcula utilizando la ecuación (12) Absorción de agua % ð Þ ¼ W w W yo W yo 100 re 12 Þ donde W w y W yo indicar el peso húmedo del andamio en intervalo de tiempo dado, y el peso seco inicial de la fisica de edad, respectivamente. Mecánico pruebas. Las resistencias a la compresión y módulos de los niños de ff sca se determinaron por la máquina de ensayo universal (LR50K Lloyd Instruments, Reino Unido) con una célula de carga 50 kN a una velocidad de cruceta de 0,1 mm / min y los datos se registraron utilizando software de ordenador (Nexygen MT; Ametek Inc., UK). Se empleó la prueba de compresión hasta que se alcanzó 10% de deformación y el módulo de compresión se calculó a partir de la región elástica inicial de las curvas tensión-deformación obtenidos de los ensayos de compresión.

In vitro prueba de bioactividad

La bioactividad de los niños de ff sca se evaluó incubando las edad sca ff en simulada de fluido corporal (SBF, pH 7,4), preparado según el método de la Kokubo. 38 edad ff Sca se colocaron en vasos de precipitados que contiene SBF polipropileno lisas y se incubaron durante 3, 7, 14, y 21 días a 37 C ( norte ¼ 5). solución SBF se actualiza cada dos días. Al final de cada período de incubación, los niños de ff sca se enjuagaron inmediatamente con dH 2 O y se secaron al vacío durante 24 h hasta se logró un peso constante. ff edad Sca se examinaron por SEM para la mineralización. El / relación de P Ca y la composición elemental de CaP formado en edad sca ff También se evaluaron mediante el uso de la relación de Ca y P intensidades de los picos obtenidos en los espectros EDS. In vitro la adsorción de proteínas en andamios. Con el fin de caracterizar in vitro proteína de adsorción capacidad, CLNPCEC y edad ff PCEC sca puras se incubaron en 2 mg / ml de solución de FBS (diluido 30 veces con PBS 0,1 M) ( norte ¼ 5). Brevemente, olds ff sca se esterilizaron con 70% (v / v) de solución de etanol durante la noche y después se aclara a fondo tres veces con solución 0,1 M de PBS. edad Sca ff fueron luego pre-humedecieron durante la noche en PBS 0,1 M a 37 C y posteriormente se incubaron en solución de FBS durante 24 h en un baño de agua con agitación ajustada a 150 r / min a 37 edad C. Sca ff se eliminaron de la solución de FBS y se lavaron con 1 ml de PBS. Finalmente, edad ff sca se incubaron con solución de SDS al 1 mL 1% durante 1 h y se enjuagaron con PBS. Se determinó la cantidad de proteína débilmente adsorbido a partir de las alícuotas tomadas de PBS utilizados en la etapa de aclarado, mientras que se determinó la cantidad de proteína fuertemente adsorbido en los niños de ff sca de las alícuotas tomadas de solución de SDS al utilizado para separar proteínas de edad sca ff. Además, la proteína total en el FBS se determinó también antes de estudio adsorción de proteínas. Brevemente, 100 metro alícuotas L de muestra de diversas diluciones de FBS en PBS se tomaron y se incubaron con 800 metro L BCA solución de trabajo en 60 C durante 15 min. La cantidad de proteína en las alícuotas se determinó midiendo la absorbancia a 562 nm con un lector de microplacas. La cantidad de adsorción de proteínas se evaluó mediante el uso de la ecuación (13).

In vitro estudios de cultivo celular

Para los estudios de cultivo de células, los osteoblastos fetal humano (hFOB, 1,19) línea celular (ATCC No .: CRL-11372) fue utilizado y las células se cultivaron en medio de crecimiento compuesto por MEM / F-12 medio nutriente de Dulbecco suplementado con 10% (v / v) de FBS y 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina a 37ºC en 5% de CO 2 atmósfera en la incubadora de dióxido de carbono (5,215 Shel Lab., Cornelius, OR, EE.UU.). Después de alcanzar 80% con fl uidez, las células se subcultivaron mediante el uso de solución / EDTA 0,1% de tripsina. Las células en tercer pasaje se utilizaron en los experimentos.

Antes de in vitro estudios de cultivo celular, olds ff sca se esterilizaron mediante incubación en etanol absoluto durante 2 h en atmósfera de presurización-despresurización cíclica y la irradiación con UV durante 30 min. Análisis de la viabilidad y la proliferación celular: La viabilidad de las células en la edad ff sca se evaluó usando el reactivo de viabilidad celular Prestoblue (Invitrogen). Brevemente, olds ff sca esterilizados se colocaron en el centro de placas de cultivo de tejido de 12 pocillos y se pre-humedecida con 0,1 M PBS durante 1 h antes de la siembra celular ( norte ¼ 8). Las células se sembraron a una densidad de 2 10 4 células / sca ff edad en el 25 metro volumen L y se dejó durante 30 min a adjuntar. Después de la siembra, olds ff sca se incubaron en medio de crecimiento durante tres días. a continuación, el medio de cultivo celular se sustituyó con medio osteogénico di ff erentiation (MEM de Dulbecco / F-12 medio nutriente complementado con 10% (v / v) de FBS, 100 unidades / ml de penicilina / estreptomicina, 50 metro g / ml de ácido ascórbico, 10 mM de segundoglicerofosfato y 10 8 M dexametasona). Las células se incubaron adicionalmente durante 14 días. Osteogénico di ff medio erentiation se renueva cada Análisis de osteogénico erentiation di ff: Para examinar osteogénico di ff erentiation de células hFOB sembradas sobre andamios, ensayo de actividad de ALP ( norte ¼ 4), osteopontina (OSP) de ensayo ( norte ¼ 3) y el ensayo fi cación cuanti calcio intracelular ( norte ¼ 4) se llevaron a cabo. edad sca ff libres de células sirvieron como controles negativos.

Brevemente, las células fueron sembradas en hFOB edad sca ff a una densidad de 2 10 5 células / sca ff edad en el 25 metro alícuotas de L y se incubaron en medio erentiation di ff osteogénico para diversos intervalos de tiempo (7, 14, 21, y 28 días). Los medios de cultivo se cambió cada dos días. Al final de cada punto de tiempo, olds ff sca recogidos se lavaron tres veces con PBS y posteriormente se incubaron con er lisis celular bu ff proporcionado con el kit de detección de ALP para determinar la actividad de ALP de las células. Los lisados celulares se recogieron y se centrifugaron a 13.000 r / min durante 3 min. Luego, el 80 metro se tomaron alícuotas L para cada muestra y se incubaron con sustrato de fosfato de para-nitrofenilo en la oscuridad durante 1 h. Después de eso, 50 metro Se añadió solución de L parada y se midió la densidad óptica a la longitud de onda de 405 nm utilizando un lector de microplacas. Los contenidos de proteína de los lisados se determinaron con metro ensayo de BCA usando la curva de calibración construida con concentraciones di ff Erent de BSA. La actividad enzimática de las células se da en términos de actividad de la enzima fi específico (nmol / mg de proteína / min). Los lisados celulares se analizaron también para contenido de ADN para estudiar la proliferación de células durante osteogénico di estudio ff erentiation. Brevemente, los lisados de células se diluyeron cuatro veces en TNE er bu ff (pH 7,4). lisado celular diluido se mezcló con colorante Hoechst 33258 en una proporción de 1: 8 (v / v). La intensidad de fluorescencia de la solución resultante se midió usando uorometer fl (Turner Biosystems, EE.UU.) y la cantidad de ADN se determinó usando una curva de calibración construida con ternero La osteopontina (OSP) de la secreción por las células se usó como un marcador de fase tardía de osteogénico di ff erentiation de las células. Con el fin de determinar la liberación acumulativa de OSP, se recogieron los medios de comunicación durante los cambios de los medios de comunicación y se almacenaron a 80 C hasta el análisis. El nivel OSP de cada grupo se determinó al final de cada semana mediante el uso de kit de detección de OSP. La densidad óptica de soluciones de productos el final se midió a 450 nm con un lector de microplacas.

Además, las cantidades de calcio depositadas por las células se determinaron en la célula utilizando lisados ensayo de o-cresopthalein. 39 Diez alícuotas de microlitros de lisados de células se incubaron en HCl 0,1 M durante la noche. La solución obtenida se mezcló con 200 metro L o-cresopthalein y ácido 8-hidroxiquinona-5-sulfónico en 2-amino-2-metil-1,3 propanodiol para formar complejo con el calcio intracelular. La intensidad del color se midió a 560 nm utilizando un lector de microplacas. edad Sca ff también se evaluaron para determinar la liberación de calcio al medio de cultivo celular. Brevemente, olds ff sca se pesaron y se esterilizó en etanol al 70% en dH 2 O. Ellos fueron incubadas en medio de cultivo celular para diversos puntos de tiempo (uno, tres, y siete días) a 37ºC en 5% de CO 2 atmósfera en la incubadora de dióxido de carbono. En cada intervalo de tiempo, se recogieron los medios y cantidades de calcio se determinaron usando un método similar antes mencionados.

Estadístico análisis. se utilizó para el análisis estadístico de los datos: una análisis de la varianza (ANOVA) con la prueba post hoc de Tukey para comparaciones múltiples utilizando el software SPSS (IBM Corporation, Nueva York, EE.UU. ver 23.0.). Di ff erences se consideraron signi fi cativa en pag 0.01. Los resultados se expresan como media desviación estándar (SD).

RESULTADOS

PCEC caracterización copolímero tribloque En el espectro de FT-IR del copolímero de tres bloques PCEC, se observaron picos característicos de FT-IR de ambos segmentos de PCL y PEG (Figura S1A). Los picos típicos de segmentos de PCL se pueden observar en 1719 cm 1 debido a la débil C ¼ vibraciones O en éster grupo carbonilo de las unidades repetidas de PCL y en 1237 cm 1 debido a -COO- vibraciones. Las bandas de absorción a 2943 cm 1 y 2865 cm 1 se atribuyeron a la -CH simétrica y asimétrica 2 - estiramiento vibraciones de homosequences de las unidades de PCL, respectivamente. Además, se observaron unidades de PEG dentro de la formulación PCEC como bandas de absorción característicos a 1162 cm 1 debido a -C-O-Cestiramiento en la -OCH 2 CH 2 - repitió unidades. La formación del copolímero tribloque PCEC era verificable ed usando 1 espectroscopia H RMN. Ambos de se observaron picos característicos de protones de unidades de PCL y PEG en el espectro de copolímero PCEC (Figura S1B). La presencia de la unidad de PCL se confirmó con los picos observados en 1,40 a 1,65 ppm, 2,32 ppm, y 4,07 ppm para los protones de - (CH 2) 3 -, -OCCH 2 -, y -CH 2 grupos OOC-, respectivamente. banda Singlet observó alrededor de 3,65 ppm confirmado la presencia de unidades de PEG homosequence dentro de la estructura. Por otra parte, un pico débil observado en 4,23 ppm se atribuyó a los grupos terminales de metileno de la homosequence PEG vinculado a homosequences PCL. Todos teórico y experimental ([ mi- TÁBANO]) relaciones de monómeros y el peso molecular promedio en número (M norte) del copolímero sintetizado se dan en la Tabla 2. M norte valor del copolímero se calculó en dos di maneras ff Erent basados en las relaciones de concentración inicial de alimentación y la relación de integridad de la 1 H RMN culmina a 4,07 ppm a los protones de metileno (-CH 2 -) de segmento de PCL y 3,65 ppm (-CH 2 -) para segmentos de PEG mediante el uso de ecuaciones dadas como información complementaria (ecuaciones complementarios (1) a (6)). Las propiedades térmicas de los homopolímeros de PEG y PCL y copolímero tribloque PCEC se presentan en la Tabla 3. La cristalinidad (X do Se encontró valor) de copolímero de estar cerca de la de homopolímero de PCL. PCL y PEG (X CPCL y X CPEG) se alteró cristalinidad homosequence en copolímero PCEC. X CPCL aumentado, mientras que X CPEG disminuido. Para copolímero PCEC, dos T re Se observaron valores atribuidos a las unidades de PCL y PEG, que confirmaron la estructura de copolímero de bloques. caracterización CLN La morfología general de las partículas CLN se da en la Figura S2 (A) a (C). CLN partículas tenían estructuras y aglomeraciones de partículas más pequeñas fl-AKE similares. los potenciales zeta de CLN en diversos valores de pH se muestran en la Figura S2 (D). Se observó que el punto isoeléctrico (IEP) del mineral CLN en pH4.65. Las partículas CLN presentan carga superficial negativa en la zona neutral (pH7.00) (Figura S2 (D)). espectro EDS de la CLN puro mostró la presencia de Si, Al, Mg, Ca, K y los elementos de S en su estructura (Figura S2 (E)). los distribución del diámetro de partícula de CLN y el valor SPAN se da en la Figura S2 (F). CLN tuvo una amplia distribución de tamaños.

Proteína de adsorción característicos de CLN fue investigada en soluciones de NaCl en fortalezas di ff Erent iónicos (0,05, 0,1 y soluciones de 0,15 M NaCl) a 37 C (Figura S3). Durante el período de incubación de 24 h, se observó un incremento en la cantidad acumulada de la adsorción de proteínas en CLN para todas las fuerzas iónicas (Figura S3 (A)). Aunque no hubo fi significativo di ff rencia entre las isotermas de adsorción observadas a fuerzas iónicas di ff Erent, CLN mostró más alta capacidad de adsorción de proteínas en solución 0,1 M NaCl (Figura S3 (B)). caracterización del andamio Determinación de la reproducibilidad de la técnica. No signi fi cativo rencia di ff en el M norte valores se observó entre el copolímero de partida PCEC tribloque (58 kDa) y sus formas procesadas en Olds sca ff (Tabla 4). Además, los cambios por ciento en peso experimentales de andamios después de NaHCO 3 lixiviación se encontró cerca de los valores teóricos de sus homólogos en cada grupo (Tabla 4). La cantidad de contenido CLN en Olds ff sca (PCEC: NaHCO 3 þ Clin%; 1: 1 þ 10% y 1: 1 þ 20%) se encontró cerca de respectivos contenidos teóricos (Tabla 4). Morfología de los andamios. De acuerdo con las imágenes de cortes transversales y de la superficie de SEM de edad sca ff, la presencia de CLN no cambió la morfología general de los niños de sca ff (dada como información complementaria, la figura S4). En todos los grupos, se observaron distribuciones de tamaño de poro ancho (Figura S4). imágenes generales y fotografía SEM a di ff Erent Magni fi caciones del SCA representante ff edad (PCEC: NaHCO 3 þ Clin%; 1: 2 þ 20%) se da en la Figura 2. estructura de poros jerárquica de ff sca de edad se observó claramente en las imágenes de cortes transversales de la ff sca de edad (Figura 2 (c)). En el interior del FF sca de edad, poros más pequeños estaban conectados a través de los poros más grandes canales.

In vitro degradación y estudio de absorción de agua

Al final del estudio la degradación, no se observó ningún cambio significativo en la integridad estructural y pesos de PCEC puro y CLN-PCEC sca edad ff (datos no mostrados). De acuerdo con los resultados del estudio de absorción de agua, 1: 2 (PCEC: NaHCO 3) grupos sca ff viejos que contienen cantidades Erent di ff de CLN mostraron absorción de agua superior en comparación con sus 1: 1 homólogos (Figura 3 (b)). Las propiedades mecánicas y la porosidad de andamios. PCEC Pura y CLN-PCEC edad sca ff se ensayaron mecánicamente hasta un 10% de deformación en los que su estructura 3D rindió. curvas tensión-deformación a la compresión de los niños de sca FF y comparación de su módulos de compresión y la porosidad abierta total se dan en la Figura 3. viejo grupo Sca que tiene de 1: 1 PCEC: NaHCO 3 relación mostró una mayor resistencia a la compresión y módulo en comparación con los demás grupos (Figura 3 (a) y (c)). Por otra parte, olds sca ff con mayor contenido de CLN proporcionan mejores propiedades mecánicas bajo compresión que el de edad sca ff con menor contenido de CLN. Los módulos de compresión también fue mayor para 1: 1 grupos que los de 1: 2 grupos que tenían mayor porosidad abierta tal como se presenta en la Figura 3 (c). El grupo sca ff edad que tiene de 1: 1 de copolímero / NaHCO 3 relación (es decir, 1: 1, 1: 1 þ 10% y 1: 1 þ 20%) se seleccionó para estudios adicionales de acuerdo con la mecánica, química y propiedades físicas de los niños de sca ff tales como resistencia a la compresión, módulo, absorción de agua, y la porosidad total. la adsorción de proteínas en los andamios. La cantidad total de proteínas de suero que fueron fuertemente y débilmente adsorbido en la edad ff SCA se da en la Figura 4 (a). Mayor cantidad de proteína se adsorbió sobre los niños de sca ff que contienen mayor contenido CLN (1: 1 þ 20%) en comparación con que adsorbido en edad ff PCEC sca puros y edad sca ff con menor contenido de CLN. A la inversa, la cantidad de proteína débilmente adsorbido en la pura ff PCEC sca de edad se encontró que era mayor en comparación con los niños de sca ff contienen CLN.

In vitro bioactividad de los andamios

Con el fin de evaluar la bioactividad de los niños de sca ff, que se sumergieron en solución SBF. Después de períodos di ff Erent de incubación, andamios se examinaron por SEM para investigar la deposición de CaP (Figura 4). precipitación de CaP en el compuesto.

edad sca ff (que contienen 10% y 20% CLN) fue visto después de tresdías de incubación (Figura 4 (b) a (d)), mientras que la precipitación de CaP en los niños de puros PCEC sca ff (1: 1) se observó en el final de una semana (datos no mostrados). Por otra parte, el examen SEM mostró que 1: 1 þ 20% (PCEC: NaHCO 3 þ Clin%) sca edad ff tuvieron mayor deposición de CaP tanto en la superficie y en las periferias de los poros (Figura 4 (e) y (f)). Además, se observó específico de aguja aparición de la hidroxiapatita en los CLN contiene edad sca ff (Figura 4 (g)). De acuerdo con los resultados del análisis elemental EDS, la presencia de elementos de Si, Al y Mg se indica el contenido CLN en los sitios de CaP donde se encontró la relación Ca / P como 1.686, cerca de la relación para la apatita ósea (Ca / P ¼ 1,67). In vitro estudios de cultivo celular. La viabilidad celular y la proliferación:

La viabilidad de las células hFOB en los niños de ff sca se controló usando un ensayo de viabilidad celular PrestoBlue, una ensayo metabólico a base de resazurina, durante 14 días (Figura 5 (a)) para estudiar la proliferación celular. La viabilidad de las células hFOB aumento durante la primera semana; Sin embargo, se observó una disminución significativa en la viabilidad de las células en la segunda semana de de incubación (Figura 5 (a)).

Además, el aumento de cantidades de ADN de células observadas durante la primera y segunda semanas mostró que el número de células aumentó en todos los grupos. Además, la más alta cantidad de ADN se encuentra en 1: 1 þ 20% (PCEC: NaHCO 3 þ Clin%) grupo de edad sca ff (que contiene mayor contenido CLN) durante todos los períodos de incubación que sugieren que las células proliferaron más en este grupo (Figura 5 (b)). Imágenes de SEM de células hFOB en 1: 1 þ 20% (PCEC: NaHCO 3 þ Clin%) ff sca de edad en los días 1 y 14 se dan en las Figuras 6 (a) y 6 (b), respectivamente. Después de un día de incubación, se observó que las células se habían extendido morfología. deposiciones de apatita sobre las zonas superficiales entre las células eran también confirmada por análisis elemental EDS (Figura 6 (b)).

Celular erentiation di ff: Se observó alta actividad de ALP para las células hFOB sembradas sobre todos los tipos de edad sca ff hasta la tercera semana (Figura 7 (a)). Sin embargo, al final de la cuarta semana, la actividad de ALP de las células disminuyó significativamente. Las células sembradas en edad sca ff contienen CLN tenían una mayor actividad de ALP en comparación con los grupos de edad sca ff sin CLN en la primera semana. células hFOB sembradas en 1: 1 þ 10% (PCEC: NaHCO 3 þ Clin%) sca ff edad muestran mayor actividad ALP al final de la primera semana. Los niveles de osteopontina liberadas por las células aumentaron en todo grupos durante cuatro semanas (Figura 7 (b)). Los niveles de osteopontina más altos se obtuvieron al final de la cuarta semana en todos los grupos. Sin embargo, las células sembradas en CLN contiene edad sca ff secretadas superior OSP durante todo el estudio. concentración OSP en 1: 1 þ 10% de edad grupo sca ff se encontró signi fi cativamente mayor que la observada en otros grupos de edad sca ff (Figura 7 (b)). deposición de calcio por las células se encontró más alta para las células sembradas sobre hFOB CLN contiene edad sca ff para la primera semana en comparación con los niños de ff PCEC SCA. Se encontraron cantidades de calcio similares para los viejos grupos todo sca ff en las siguientes semanas (Figura 7 (c)). En la cuarta semana, la deposición de calcio por las células de forma significativa disminuyó en comparación con la primera semana. la concentración de calcio intracelular de células hFOB sembró en 1: 1 þ 10% edad ff sca fue significativamente mayor que todos los otros grupos al final de la primera semana (Figura 7 (c)). 

Se evaluó la liberación de calcio de edad sca ff en los medios de cultivo celular (Figura 5 (c)). liberación de calcio más alta se observó en el 1: 1 þ 10% ff sca grupo de edad. Sin embargo, no hubo significantes rencia di ff entre 1: 1 þ 10% y 1: 1 þ grupos 20% (Figura 5 (c)).

DISCUCION

Polymer-minerales edad sca compuesto ff se han estudiado ampliamente en ingeniería de tejido óseo, lo que proporcionaría la combinación de propiedades únicas deseadas de cada uno de sus componentes. 40,41 En la literatura, colada con disolvente y procesamiento en estado fundido están entre los métodos ampliamente utilizados para producir hueso compuesto edad sca ff basados en polímeros. 42,43 Sin embargo, el uso de disolvente en la producción de los niños de sca ff causa una preocupación de biocompatibilidad para la posibilidad de disolvente residual que queda en el andamio. 44 Además, hay una variedad muy limitada de polímeros para tratamiento en masa fundida debido a los problemas reológicas. 45 Por lo tanto, los métodos olding alternativa sca ff, que evitan el uso de disolventes y procesamiento en estado fundido, aún se requieren. Para la producción de tejido óseo en 3D edad sca ff, controlar la porosidad y la interconectividad de los poros son cuestiones importantes. 

La adhesión celular en edad sca ff y la posterior penetración en el sca edad ff dependen en los tamaños de poro, mientras que la interconectividad promueve el transporte de nutrientes y el intercambio de producto de desecho, por lo tanto, el tejido en filtración, y la reparación ósea ciente e fi. técnica de lavado de partículas se utiliza para producir constructos 3D porosos interconectiva por porógenos partículas lixiviación fuera de la construcción cuando empapado en disolvente apropiado. 48 En nuestro estudio, CLN-PCEC copolímero tribloque edad ff sca compuesto se prepararon por un método reproducible sin el uso de procesamiento de disolvente y fusión para preparar edad sca ff biocompatible, biodegradable, altamente porosas, interconectiva y mecánicamente fuertes para ingeniería de tejido óseo. copolímero tribloque PCEC se sintetizó y se caracteriza. Tanto de los picos característicos de FT-IR de segmentos de PCL y PEG se observaron en el espectro de acuerdo con la literatura (Figura S1 (A)). Adicionalmente, 1 espectro de H RMN del copolímero de tres bloques PCEC exhibió la característica 1 H bandas de desplazamiento químico como se informó en los estudios anteriores (Figura S1 (B)). 51 Además, la formación del copolímero tribloque se confirmó con el pico de protones alrededor 4,23 ppm procedente de los hidrógenos en el enlace PCL y PEG. 52 De acuerdo con los resultados de DSC, se encontró que el porcentaje de cristalinidad del copolímero tribloque PCEC próxima a la del PCL homopolímero (Tabla 3). T metro, T do, y H metro valores de copolímero PCEC se encontraron altos que los de homopolímero PCL debido a la presencia de segmento de PCL con el peso molecular más alto en la estructura de copolímero a diferencia de para el homopolímero de PCL. 53 Dahamaniya et al. 54 informaron que el aumento de longitud de la cadena homosequence de poli semicristalino (ácido láctico) en la estructura copolimérica tribloque de PLA-b-PHIT-BPLA resultó en incremento de X la cPLA. Del mismo modo, X CPCL incremento en el PCEC se produjo después de la polimerización debido al aumento de longitud de la cadena homosequence. Di ff diferencial curva termogravimétrico de de tres bloques copolímero mostró dos pasos de pérdida de peso debido a la descomposición de segmentos de PCL y PEG en el copolímero (datos no presentados), lo que confirma la estructura de copolímero de bloque. De acuerdo con la comparación de la T re valores de copolímero y homopolímeros, la estabilidad térmica del copolímero de PCEC fue mayor que la de los homopolímeros de PCL y PEG puras. En un estudio similar, Wang et al. 56 estudiado copolímero de bloque PCEC y se encontró que el aumento de T re de las mezclas fue asociada con el incremento en la estabilidad térmica.

Se observaron formaciones Placa para CLN de fl akelike estructuras en el análisis SEM (Figura S2 (A) a (C)). En otro estudio, Ahmad et al. 57 mostraron que las partículas de hidroxiapatita de forma irregular contribuyeron a la compactación de sí mismos y matriz de polietileno. Por lo tanto, se esperaba que las partículas de tamaño CLN Erent irregular y di ff para fortalecer el enclavamiento mecánico entre sí y también con PCEC copolímero matriz bajo compresión durante la preparación del CLN-PCEC edad compuesto sca ff. Como se explica en otro estudio, las partículas de hidroxiapatita de mayor tamaño (50 metro m) proporcionar flujo mientras que las pequeñas partículas de hidroxiapatita (4 metro m) permitir que el embalaje más fuerte. 58 En consecuencia, el tamaño de partícula polidisperso (1-50 metro m) de CLN se cree que aumenta la compactación durante la compresión de polvo. capacidad de adsorción de la proteína de las zeolitas depende del punto isoeléctrico (IEP) de las proteínas, la estructura química de las zeolitas, y el pH del medio ambiente. 59,60 Para investigar la adsorción de proteínas sobre las partículas CLN, BSA fue elegido como una proteína modelo, debido a su carga negativa neta en el pH neutro. 61 CLN fue finamente dispersado y suspendido en la solución BSA debido a su buena estabilidad en pH neutro determinado por análisis del potencial zeta. Se observó que tenía CLN especie básica (OH iones) en una solución a pH 7,4 (Figura S2 (D)) y CLN y BSA tienen IEP alrededor de pH 4,6 y 5,4, respectivamente. Aunque se encontraron los potenciales zeta de las CLN y la proteína a ser similares a pH neutro, BSA resultados de adsorción (Figura S3 (A)) mostraron que CLN podría adsorber BSA a pH 7,4. CLN interactúa fácilmente con el medio ambiente debido a sus iones cargados positivamente, tales como Mg 2 þ, California 2 þ, K þ y también tiene alta capacidad de intercambio iónico en la superficie debido a su pequeña relación de Si / Al (5,73). 62,63 Por otra parte, se observó que la fuerza iónica del medio ambiente no tenía fi significativo e ff ect en la capacidad de adsorción de proteína de la CLN (Figura S3 (B)). Como se estudió en un estudio previo, la adsorción de proteínas en hidroxiapatita favorece la cinética de Langmuir Por lo tanto, CLN podría haber generado una superficie de adsorción favorables para la adsorción de BSA y BSA en él obedeció la cinética de Langmuir.

La presencia de la CLN en los niños de ff sca no causó fi cante di ff rencia significante en la arquitectura de los poros en comparación con sus homólogos sin CLN. La morfología de los poros dentro de la ff sca edad solamente puede depender de la forma general y las dimensiones de la aHCO 3 partículas y sus aglomeraciones en la matriz de copolímero. Según el análisis SEM de edad sca ff, el aumento en la cantidad de NaHCO 3 al copolímero relación (w / w) de 1: 1 a 1: 2 causó un aumento en la porosidad total de los niños de ff sca como se esperaba (Figura 3 (B)).

Además, los microporos (1 metro m) se observaron además de macroporos (> 100 metro m) la demostración de la estructura porosa interconectiva de los niños de sca ff (Figura 2). Los macroporos en antigua estructura de la sca ff proporcionan mayor área superficial para la proliferación celular y el crecimiento de tejido en el sitio implantado. sesenta y cinco Además, las aberturas Interpore microporosas entre macroporos proporcionan una mejor unión celular en los niños de sca ff al tiempo que facilita la eliminación ow y los residuos fl nutrientes. 66 Existencia de gradiente de tamaño de poro en la estructura de edad sca ff se sabe que causa más rápido y mejor cicatrización ósea. 67 Del mismo modo, la interconectividad de los poros y la porosidad elevada en todo viejos grupos sca ff proporcionan un área superficial grande, causando una mayor absorción de agua. 68 La porosidad influye en la capacidad de absorción de agua de los niños de sca ff. edad Sca ff que tiene de 1: 2 (PCEC: NaHCO 3) relación tenía mayor porosidad (Figura 3 (c)) y la capacidad de absorción de agua (Figura 3 (b)) en comparación con sus homólogos que tienen una relación 1: 1. Además, los iones catiónicos en CLN tales como Ca 2 þ, mg 2 þ, N / A 2 þ proporcionar fuertes sitios de adsorción de agua. 69 En consecuencia, la presencia de la CLN en los niños de ff sca mejorado de adsorción de agua (Figura 3 (b)). Hinchazón estudio mostró que PCEC puro y andamios CLN-PCEC pueden contener una considerable cantidad de agua dentro de la estructura. capacidad de absorción de agua de los niños de sca ff ff puede o capacidad de ER para las proteínas y otros solutos corporales para ser transportado dentro y fuera de la ff sca de edad y estimular la invasión celular. 70 CLN-PCEC sca edad ff mostraron una degradación insignificante durante dos meses en PBS en condiciones estáticas. Porosidad de edad ff sca no tenía fi significativo e ff efecto sobre la degradación hidrolítica de edad sca ff. copolímero PCEC en los niños de ff sca se sintetizó mediante la apertura de anillo de polimerización (ROP) donde las unidades de PCL y PEG estaban unidos por enlaces covalentes a través de enlaces éster en la cadena principal. Como se informó en la literatura, homopolímero PCL y copolímero PCEC se someten a la escisión hidrolítica en el esqueleto de poliéster y muestran una pérdida de peso exponencial con el tiempo. 71 Además, también se ha indicado que la degradación hidrolítica se puede acelerar en ambientes agresivos tales como los medios ácidos o básicos para niños de sca ff basados en PCL.

En las curvas de esfuerzo-deformación, los niños de sca ff con 1: 2 (PCEC: NaHCO 3) relación mostró región de la meseta después de 3% de deformación mientras que se observó aumento continuo por encima del 3% de deformación para su 1: 1 de copolímero / NaHCO 3 homólogos (Figura 3 (a)). La región de la meseta ilustra el colapso de la estructura porosa, mientras que la región fi cación DENSI representa la pérdida de soporte mecánico procedente de la estructura 3D. 73 Por lo tanto, se detectó un 10% de valor de deformación como el final de la región de la meseta donde la arquitectura 3D fue completamente destruida. En nuestro estudio, el fallo bajo compresión comenzó a finales de región elástica lineal cerca de 3% de deformación para todos los grupos. Sca edad de FF en 1: 2 grupo muestran estructura de espuma elastomérica mientras que 1: 1 grupo está representada la naturaleza elástica-plástica de espuma. viejos grupos Todo sca ff mostraron tendencias similares en la región elástica lineal (Figura. 3 (a)). aumento inicial en el módulo de viejos grupos tanto sca ff con 1: 1 y 1: 2 proporciones podría considerarse como el resultado de la elasticidad originó a partir de matriz de copolímero. Sin embargo, la porosidad global de los grupos podría haber causado debilidad en la resistencia a la compresión de ambos grupos. Como se indica en la literatura, 74 Por lo tanto, menor porosidad de edad sca ff con Relación 1: 1 proporcionado extensas propiedades de compresión en comparación con sus contrapartes con relación 1: 2 (Figura 3 (a) y (c)).

Además, la presencia de CLN en los niños de ff sca permitió que la resistencia a esfuerzos de compresión más altas en comparación con los niños de sca ff sin CLN. Por lo tanto, se observaron los valores más altos de móduli y resistencia final a la compresión para niños de sca ff con la mayor cantidad de contenido CLN y la porosidad más baja (Figura 3 (c)). La cantidad de proteínas de suero débilmente adsorbido en viejos grupos de la sca ff se encontró mayor en comparación con la cantidad de fuertemente adsorbidos proteínas que se encuentran en estos grupos. la adsorción de proteínas débil en los niños de ff PCEC sca compuestos y puros CLN-PCEC podría estar relacionada con el movimiento de la proteína en los poros de los niños de sca ff durante la incubación. Por otro lado, robustos interacciones electrostáticas entre las proteínas y las superficies viejos sca ff conducen a la adsorción de proteínas fuerte. 75 Además, se informa de que la presencia de un contenido de minerales en la estructura positivamente un ECTS ff el proceso de adsorción de proteínas en edad ff SCA. 76 Por estas razones, el contenido CLN en los niños de ff sca aumentó la adsorción de proteínas, mientras que los niños de ff PCEC puro sca mostraron la capacidad de adsorción de proteínas de suero más bajo (Figura 4 (a)). Además, el aumento de la adsorción de proteínas de suero en los niños de sca ff puede crear una mayor área de superficie donde la matriz extracelular (ECM) de proteínas de células adhesivo son adsorbidos y, posteriormente, mejorar la unión celular a los andamios. 77 En un estudio previo, Kim et al. mostraron que los niños de sca ff proporcionando buena adsorción de proteínas de suero de aumento de la proliferación celular. 78 En consecuencia, una mayor adsorción de proteínas en CLN contiene edad ff sca puede dar lugar a robusta unión celular, la proliferación y osteogénico erentiation di ff.

En todos los grupos sca ff viejos, CaP mineralización se produjo en solución SBF (Figura 4 (b) a (g)). Formación de precipitación CaP en edad ff SCA que contiene CLN ocurrió más rápido que los niños de sca ff sin CLN (Figura 4 (b) a (g)). precipitación CaP podría ser fácilmente inicia con la interacción de los iones fosfato de la solución de SBF con la CLN debido a la presencia de iones de calcio y magnesio cargados positivamente en la periferia del núcleo marco de sílice-alúmina de CLN. De acuerdo con los resultados de análisis del potencial zeta de la CLN, la superficie de la CLN estaba cubierto con iones OH. Los iones hidroxilo son especialmente importantes en el reclutamiento de los iones de calcio cargados positivamente a la superficie y, posteriormente, iniciar la precipitación de CaP. 79 Además, sílice en la columna vertebral de la CLN es osteoinductivo en términos de reclutamiento de iones de calcio de refuerzo los iones fosfato para la nucleación de apatita. 80 Para 1: 1 þ 20% (PCEC: NaHCO 3 þ Clin%) niños de sca ff, relación inicial Ca / P en la primera semana (1,98) se encontró similar con la relación de CaP precursor de apatita biológica. 81 Se observó: Por lo tanto, la deposición de hidroxiapatita (1,686 Ca / P) en el viejo sca ff que contiene la cantidad más alta de CLN (20%) (Figura 4 (g)).

Con el fin de determinar citocompatibilidad de los andamios, las células fueron sembradas en hFOB CLN-PCEC edad ff PCEC sca compuestos y puros. células hFOB sembradas sobre puro PCEC edad sca ff mostraron una mayor viabilidad en comparación con los niños de ff SCA que contiene CLN (1: 1 þ 10% y 1: 1 þ 20%) Antiguos sca ff al final del primer semana (Figura 5 (a)). Además, la cantidad de ADN determinación mostró que el número de células aumentó para todos los grupos, mientras más alto CLN grupo, 1 que contiene: 1 þ 20% edad sca ff, muestran mayor número de células a lo largo de los períodos de incubación (Figura 7 (b)). Aunque CLN contiene edad sca ff (1: 1 þ 10% y 1: 1 þ 20%) mostró la adsorción de proteínas significativamente más alto que los 1 puros: edad ff 1 sca, la unión celular inicial de células en todos los niños de ff sca no fue significativamente di ff Erent (Figuras 5 (a) y 7 (b)). Un hallazgo similar fue reportado por Peter et al. 82 Observaron que la incorporación de nanohydroxyapatite significativamente mejorado la adsorción de proteínas de suero; sin embargo, 24-h análisis de viabilidad celular mostró insigni fi no puede di ff rencia en la viabilidad celular entre los grupos de compuestos y puros. Además, Gaharwar et al. producido un ff sca compuesto a base de PCL de edad con nanoarcilla. 83 Ellos observaron que, aunque la adsorción de proteínas fue mayor con la nanoarcilla enriquecido edad sca ff, hubo un insigni fi cante di ff rencia en la unión celular. Por lo tanto, se concluyó que las propiedades estructurales de edad sca ff pueden contribuir más para la unión celular. 83 Por otro lado, la disminución de la viabilidad celular se puede explicar por la osteogénico di ff erentiation de células hFOB en medio osteogénico (observado con la actividad de ALP y la deposición de calcio intracelular en la semana 1, las Figuras 7 (a) y 7 (c)). Del mismo modo, Rodrigues et al. informado de que la viabilidad celular significativamente disminuye mientras que las células di ff erentiate. 84 Otro hallazgo similar fue reportado previamente en la literatura.

La morfología celular de las células hFOB en edad ff sca se muestra en la Figura 6. Las imágenes SEM tomadas después de la primera días de incubación mostraron que hubo extensa rugosidad de la superficie en los niños de sca ff proporcionar un sustrato adecuado para la adhesión de las células (Figura 6 (a)).

Por otra parte, también se observó que las células hFOB migraron en los poros y formaron fi lopodia en las proximidades del CLN. Las células se habían extendido sobre todo morfología que sugiere que las propiedades de superficie de los niños de ff sca fueron adecuados para la unión celular inicial (Figura 6 (a)). Cuando las células se incubaron hFOB durante 14 días, la superficie de los niños de ff sca estaba cubierto por células hFOB y se produjo la deposición de minerales (Figura 6 (b)).

ALP, un marcador osteogénico temprano, se regula positivamente durante el compromiso osteogénico. 86 Los niveles de ALP de las células sembradas sobre hFOB edad sca ff contienen CLN (1: 1 þ 10% y 1: 1 þ 20%) alcanzó un máximo de la primera semana, mientras Los niveles de ALP de las células en pura PCEC sca ff edad alcanzaron un máximo de la tercera semana. Se observó la actividad de ALP más alta de células en 1: 1 þ 10% de edad grupo sca ff al final de la primera semana (Figura 7 (a)). Además, significativamente mayor liberación OSP, un marcador tardío de osteogénico di ff erentiation, también se observó a partir de las células sembradas en los niños de sca ff contienen CLN y los niveles de OSP para estos niños de ff sca alcanzó su punto máximo en la tercera semana (Figura 7 (b)). 87 De acuerdo con ALP y los resultados de OSP, el aumento de las deposiciones de calcio intracelular se encuentran en las células sembradas sobre hFOB 1: 1 þ 10% y 1: 1 þ 20% edad sca ff (Figura 7 (c)). Las células comienzan la ingesta de calcio antes de la última etapa de erentiation osteogénico di ff. 88 Entonces, el calcio es liberado para formar depósitos de CaP que a su conductor de retorno a la nucleación de apatita natural y la formación de ECM hueso. 89 De acuerdo con la literatura, la regulación positiva ALP alcanzó su punto máximo tan pronto como al final de la primera semana de los niños de sca ff contienen CLN. Los niveles de OSP en los medios de cultivo aumentó gradualmente durante el estudio en todos los grupos, mientras que el contenido de calcio intracelular alcanza su concentración máxima al final de la tercera semana y disminuyó rápidamente después de la iniciación de osteogénico erentiation di ff. Por otra parte, la liberación de calcio mayor de 1: 1 þ se observó 10% edad sca ff en medios de cultivo celular (Figura 5 (c)). Las cantidades liberadas (9,4 mm de 1: 1 þ 10% y 7,9 mm de 1: 1 þ 20% edad sca ff) no fueron en los niveles citotóxicos reportados en el estudio de Olkowski et al Como se informó en la literatura, celular di ff erentiation en los niños de sca ff depende de varios criterios. Las propiedades mecánicas, estructurales y biológicas de los andamios de fi ne el resultado de la proliferación celular y los estudios ff erentiation di. 91 Como se informó anteriormente por Witkowska-Zimny et al., Aumento de la resistencia mecánica de los niños de ff sca con mayor contenido de CLN podría haber proporcionado un mejor sustrato para la proliferación celular hFOB (Figura 5 (b)). 92 Sin embargo, aumento en el contenido CLN también dio lugar a la absorción de agua menor y la porosidad que son propiedades muy importantes de la edad ff sca para la colonización celular y la permeabilidad a su entorno inmediato. 93 Por razones antes mencionadas, 1: 1 þ 10% edad sca ff se encontró mejor en términos de inducción osteogénica de hFOB que el 1: 1 þ edad 20% ff sca, probablemente debido a la liberación de calcio superior al 1: 1 þ 20% edad sca ff (Figura 5 (c)). 1: 1 þ 10% edad sca ff actuaron como una mejor intermedio entre los criterios dados más arriba. Tenían mayor porosidad, absorción de agua y mejores propiedades mecánicas que los niños de ff PCEC sca puros.

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