ANTICANCER Y EFECTOS ANTIOXIDATIVOS DE LA CLINOPTILOLITA MICRONIZADA DE ZEOLITA

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NEVEN ZARKOVIC, KAMELIA ZARCOVIC, MARIJETA KRALJ, SUZANA BOROVIC, SENKA SABALOVIC, MARIJA POLJAK BLAZI, ANA CSTILL Y KRESIMIR PAVELIC

Ruder Boskovic Institute, División de Medicina Molecular, Zagreb, Faculry Médico, Centro Hospitalario Clínico "Zagreb", Instituto de Patología, División de Neiropatología, Zagreb, Hospital Clínico "Dubrava" Zagreb, Croacia.

Antecedentes: El tratamiento de ratones y perros cancerosos con clinoptilolita de zeolita micronizada (MZ) condujo a la mejora del estado de salud, la prolongación de la vida útil y la disminución del tamaño del tumor en algunos casos. También redujo la peroxidación lipídica en el hígado.

Materiales y métodos: Los experimentos se realizaron en varios cultivos de células tumorales y animales portadores de tumores. La inmunohistoquímica se utilizó para analizar si MZ podía interferir con la peroxidación lipídica inducida por Doxorubicina y la producción de consequemias de 4-hidroxinonenal (HNE).

Resultados: MZ redujo el tasa metabólica de las células cancerosas y aumentó la unión de HNE a la albúmina in vivo. Redujo selectivamente la generación de HNE in vivo en estroma tumoral después del tratamiento con Doxorubicina dejando el inicio de la peroxidación lipídica intacta en las células malignas. El tratamiento combinado con Dexorubicina y MZ resultó en una fuerte reducción del recuento de metástasis pulmonar aumentando los efectos anticancerígenos de la dexorubicina.

Conclusión: la interferencia de MZ con la peroxidación lipídica podría explicar algunos de los efectos beneficiosos de esta zeolita en particular en la terapia oncológica combinada.

La zeolita natural son minerales volcánicos con características únicas. su estructura química los clasifica como aluminosilicatos hidratados, compuestos de hidrógeno, oxígeno, aluminio y silicio, dispuestos en una estructura de celosía interconectado.Su estructura única hace que las zeolitas sean diferentes de otros aluminosilicatos, debido a su capacidad de absorción de gas agua e intercambio iónico.

Dado que muchas prosas bioquímicas están estrechamente relacionadas con el intercambio de iones, la absorción y la catálisis, se cree que la zeolita natural y sintetica podría hacer una contribución significativa a la industria farmacéutica y la medecina en un futuro próximo. Por ejemplo, algunas zeolitas ya se utilizan como medio de contraste en métodos de diagnóstico, como fármacos antidiarreicos, antibacterianos y antifúngicos, como apoyo a enzimadores y anticuerpos, etc. También se utilizan en la curación de cortadas y heridas y son muy afectivos como un glucosa absorbente, por lo que los pacientes con diabetes mellitus podrían usarlos. Se unen de forma reversible a moléculas pequeñas como el óxido nítrico u oxigeno, poseen selectividad de tamaño y forma, la posibilidad de imitación de la metaloenzima y tienen actividad inmunodulora.

Nuestros resultados previos mostraron que el tratamiento con clinoptilolita de ratones y perros que sufren de varios tipos de tumores condujo a la mejora del estado de salud general, la prolongación del lapso de la vida, y la disminución del tamaño del tumor en algunos casos. En la adición, los estudios toxicológicos en ratones y ratas demostraron que el mismo tratamiento no tuvo ningún efecto negativo. Los estudios de cultivo de tejido in vitro mostraron que la clinoptilolita finamente molida inhibió la proteína quinasa b (c-act), indujo proteínas supresoras de expresión p21 y p27 tumor y proliferación celular inferida en varias líneas celulares cancerosas.

La evidencia cumulada ha indicado que la zeolita juega un papel importante en la modulación del sistema inmunológico. Los linfocitos de los ganglios linfáticos de ratones sanos alimentados con MZ durante 28 días provocaron una reacción alogénica de injerto contra huésped (GVH) significativamente mayor que las células de los ratones de control. Después de i. p. aplicación de MZ, se observó la translocación de p65 (NFkB subnit) al núcleo de las células del bazo. Del mismo modo, se demostró que la exposición de macrófagos alveolares a partículas de silicato conduce a la activación de las quinasas de proteínas activadas con mitógenos (SARK), mientras que el factor de transcripción como AP-1 y NFkB también se activan y se expresióna de citoquinas proinflamatorias se ha mejorado la serie de sistemas como IL-6 o TNF-a.

En ratones sanos se dan MZ durante 28 días, la concentración de ácido siálico ligado a lípidos (LSA) en suero se incrementó, pero el peroxidato lipídico en los hígados disminuyó, lo que indica los posibles efectos antioxidantes sistémicos de MZ. Los oxidativos en las células cancerosas pueden activar constantemente factores de transcripción, como NFkB,a través de la transducción de señal intracelular e inducir la expresión de proto-oncogenes como c-fos,c-jun y c-myc. Además del estrés oxidativo induce daño al ADN como productos modificados y roturas de hebras, que pueden conducir a una mayor mutación y aberración cromosómica del cáncer. Los efectos cancerígenos de las especies reactivas de oxígeno(ROS) son bien conocidos, así como sus efectos citotóxicos, cuando inducidos por la radio y/o quimioterapia. Además, algunas células tumorales se resisten a la citólisis oxidativa, mientras que el estrés oxidativo también puede activar sistemas antioxidantes en las células cancerosas que podrían hacer que las células cancerosas sean resistentes a la quimioterapia.

La peroxidación lipídica es una parte integral del estrés oxidativo, lo que resulta en la producción de aldehídos reactivos, tóxicos,  el producto final de la peroxidación lipídica denotada también es " segundas masacres de radicales libres" entre las cuales las más conocidas son malondialdehyde (MDA) y4- hidroxinoal (HN). HNE también se conoce como un factor modificador del crecimiento y la edad proapoptotico dependen de su alta afinidad para unirse a las proteínas celulares. Dado que MZ es capaz de reducir la peroxidación lipídica in vivo. Parece probable que en podría interferir con los efectos de HNE, también.

Presentamos nuevas pruebas para el antitumoral en la actividad antioxidante de MZ, así como su posible mecanismo de acción in vivo.

Materiales y métodos:

Zeolita micronizada (MZ). Se utilizó clinoptilolita de zeolita natural tribomecánicamente micronizada (MZ) de Eslovaquia, con características descritas. Además, la estructura nano y cristalina de zeolita micronizada y no micronizada se midió utilizando la dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) y la espectroscopia de dispersión de rayos X de gran angular (WAXS) en la línea austriaca de haba SAXS de alto flujo de anillo de almacenamiento 2GeV ELECTRA ( Trieste Italia) no hubo una distinción pronunciada y características no estructurales (estructura vacía) entre muestras micronizadas y no micronizadas.

Medición de la proliferación celular (ensayo MTT). El efecto de MZ en la proliferación celular in vitro fue estudio en varias líneas celulares humanas: HeLa (carcinoma cervical) MiaPaCa2 (carcinoma pancreático) CaCo-2 (carcinoma de colon) MCF-7 (cáncer de mama) las células se mantuvieron en DMEM complementado con 10% de suero fetal de la pantorrilla (FCS Sigma USA) son condiciones estándar. Para los experimentos de ensayo de proliferación, las células fueron chapadas a un destino de 3 x 10 ml en placas de 96 micropocillos (200 pl/pozo) (Greiner, Alemania) después de la incubación durante la noche, el medio fue reemplazado por DMEM fresco que contiene diferentes concentraciones ( 0,05 mg/ml) de MZ. después de 72 horas de incubación, las células se lavaron suavemente con PBS para eliminar MZ. La viabilidad celular se determinó utilizando el ensayo MTT (Sigma) que detecta la actividad de la deshidrogenasa en células viables. El análisis estadístico se realizó utilizando la prueba De nova unidireccional. Se aceptó un nivel de p<que 0,01 como estadísticamente significativo. 

Animales y tratamientos. Los ratones fueron criados en el Centro de Animales del Router Boskovic Instituting y las ratas fueron obtenidas del Instituto de Investigación Médica en Zagreb, Croacia. Alimentos (Domzale, Eslovenia) y agua del grifo dada y libitum. Los animales se mantuvieron en circunstancias convencionales: ritmo claro/oscuro 12/12 horas, temperatura 22 C y humedad 55%.

Efecto antimetastásico de la doxorubicina MZ. Se utilizaron ratones CBA/HZ gr de 3,5 meses de edad con carcinoma mamario para estudiar los efectos de Doxorubicina y MZ en el desarrollo de metástasis pulmonar artificiales, se utilizó el carcinoma mamario espontáneo desarrollado en ratones de cepa CBA/HZ gr en el experimento. La célula tumoral se obtuvo de los ratones tumorales sacrificados y las células vivas 5x10 (según la exclusión azul de Trypan dando menos <35% de las células azul-positivas trypan) inyectadas i.v. en la vena de cola del ratón en efectivo. Doxorubicina se administró mediante una única inyección i.p. un día después de la inyección de las células tumorales a una dosis de 10 mg/kg. 

MZ se aplicó en el agua del grifo dado añadir liberum (0,5 g/kg dosis media diaria) Esta vía de aplicación y dosis se eligió porque se asemeja a los protocolos utilizados para ellos terapia del paciente oncológico (Dr., D zapcic, comunicación personal) el consumo de agua del grifo por cada animal se determinó durante dos semanas antes del comienzo del experimento para determinar la concentración de la sustancia necesaria para alcanzar la dosis media diaria de aproximadamente 0,5 g/kg. para la aplicación diaria de MZ, se preparó una solución fresca de la sustancia cada segundo día. los animales de control fueron tratados por igual con salina i.p. y agua corriente del grifo solamente.

Los ratones se mantuvieron vivos hasta el día 18 cuando fueron sacrificados por el éter y la autopsia se realizó para verificar el desarrollo de la metástasis tumoral y contar los nódulos tumorales en los pulmones. los largos se fijaron después en 10% de formalina para la evaluación patohistológica, mientras que las diferencias en el número de nódulos tumorales pulmonares fueron evaluadas por la prueba del estudiante. 

Efectos de la ZM en el estrés oxidativo inducido por doxorubicina en el carcinoma de ratas W256. Para estudiar los efectos del estrés oxidativo inducido químicamente por MZ utilizamos ratas Wistar macho de seis meses de edad con Walker 256 carcinoma (W256) con un peso de 308 más o menos 25 gramos tratados con antracciclina (Doxorubicina, Sigma, EE.UU.) que logra la actividad anticancerígena por inducción de peroxidación lipídica en células malignas. Las células del carcinoma W256 (10 células de rata) se inyectaron es decir, en la extremidad posterior. Seis días más tarde, cuando el tumor tenía 3-4 cm de diámetro, las ratas se dividieron en grupos de 4-6 animales: 1) controles, 2) ratas tratadas con MZ, 3) ratas tratadas con Doxorubicina i.p., 4) ratas tratadas con MZ y Doxorubicin i.p. MZ se administró por os por sonde en un solo dos veces e de 2 g/kg una hora antes de la inyección de Doxorubicina 10 mg/kg después de tres horas de muerte de los animales, los tumores fueron extirpados y almacenados en una formalina tamponada del 10% para ser utilizada para la inmunohistoquímica de conjugados de proteína HNE en el tejido tumoral.

Inmunohistoquímica de HNE-Conjugados de proteínas en el tejido del carcinoma W256.  Sección de tejido (5pm) de la parafinafija de formalina- se utilizaron tumores incrustados. Para la detección inmunohistoquímica (uso de peroxidasa-métodode antiperoxidasa)deHNE-proteínaconjugadose utilizaron,comodescrito anteriormente. Los anticuerpos monoclonales para la detección de conjugados de proteínas HNE se obtuvieron del medio de cultivo del clon derivado de una fusión de células de mieloma Sp2-Ag8 con células B de un ratón BALB c inmunizado con la encogida de agujeros de cerradura modificada por HNE hemocyanina(Instituto de Bioquímica graz, Austria) el anticuerpo es específico para elepítopo HNE-histidina en conjugado de proteína HNE (péptido).

Analizar las posibles diferencias en la intensidad de la tinción de HNEentre los tumores de diferentes-animales tratados, evaluación semi-cuantitativa fuerealizada por el patólogo y definido en grados de intensidadde tinción como sigue (-) negativo; (+) tinción débil (<5% de las células) (++) tinción moderada (unpproxicopitamente 25% de las células) y (+++) tinción fuerte(>- 50 - 75% de la cells) después de que los grados immunopositividad manchados fueron asignados a valores numéricos respectivos de 0 a 3 y evaluados por dos prueba No paramétrica mann Whitney U-test, considerando p<b5 como un indicador de diferencia.

Influence de MZ en HNE unión a la albúmina sérica. Elpunto-blot semicualitativo  se encontróconhod utilizando anticuerpos monoclonales específicos elevados contra HNE-histidina conjugado se aplicó para determinar la interferencia de MZ que la puerta era de MC con el desarrollo de conjugados de proteínaHNE.MZsolución essalinepreparado mediante el uso de un ultrasonidobaño de agua(transsónico 3 Elma)durante 30 minutospara lograr polvo apenas soluble.la solución fueque centrifugado en500 gpara10 minutos(Heraus, Labofuge 400)Para eldespués del experimento que utilizamos tpor lo tanto obtuvo sobrenadante.Boviesalbúmina (BSA Haemosan, Austria)en3 concentración de 10mg ml fuemezcladoen igualrelación de volumencon el sobrenadante de MZ 400 mg ml solución y HNE. después de una incubación de 30 minutos aplicamos muestras de solución de 50mg como la muestra original ymisma diluciónde 1:1 y 1:100 (todo en duplicados) en las membranas de nitrocelulosautilizandoelpunto-bsistema de lavado de lote(Alemania)

Resultados

El efecto de MZ en la proliferación de líneas celulares in vitro (MTT-ensayo) los efectos de MZ en el crecimiento de diferentes líneas celulares de cáncer humano se presentan en la figura 1.el crecimiento de all célulalíneas excepto, Hep2,se inhibió significativamente,enuna manera dependiente de la dosis. La inhibición más fuerte se observó con las células HeLa y MiaPaCa2. MZ en la concentración de 0,05 mg/ml significativamente (p<0.01) inhibió la viabilidad de estas dos líneas celulares (para20-30%)a una concentración de 0,5 mg/ml, la viabilidad de las líneas celulares HeLa y MiaPaCa2 se inhibió entre un 50 y un 60 %, respectivamente.la viabilidad deotras líneas celulares fuesignificativamente inhibido sólo enconcentración de 0,5mg/ml.

Effects de MZ and doxorubicina en el desarrollo de artificial lung metastasis de carcinoma mamario. Losefectos de ladoxorubicina de Doxorubicina y MZ administrados alone o en tratamiento combinado, en la formación de metástasis pulmonar artificial de m suine mammiunry carcinoma se presentan en la tablaI.

Doxorubicina dada en una sola dosisde 10 mg/ml, no redujo el recuento de metástasis (p<0.1) de manera similar MZ administrado diariamente en agua del grifono influyó en el desarrollo de las metástasis pulmonares (p<0.1) pero la combinación diaria de la aplicación MZ con Doxorubicina dio lugar a la reducción del recuento de metástasis que fue significativo tanto si se compara con el control (p<0.1) o con el grupo tratado únicamente por doxorubicina (p<0,001)

Effects de MZ en química-estrés oxidativo inducido of W256 carcinoma in vivo. Los resultados de la evaluación lógica delcarcinoma W256 tratado con doxorubicina MZ o el tratamiento combinado se resumen en el Cuadro II. Aunque no hubo diferencias generales en laapariencia lógica pathohistode tumorestratados de manera diferente, doxorubicina indujo peroxidación lipídica prominente both encélulas malignas(p<0.2) La positividad más intensiva de HNE fue notado en las células tumorales cerca de la necrosisbothpara el controlypara tumores tratados con doxorubicina,MZ en sí no cambió lainmunohistoquímicosapariencia deHNE-proteínas en comparación con los conjugados no tratadostumor (p<0.05)sin embargo, tenía efectos específicos de tejido selectivo en doxorubicina inducidaestrés oxidativolípidos(HNE-conjugados de proteínas) en células malignas(p<0.1)mientras que se evitó por completode HNE-conjugados proteicosen el estroma tumoral (p.0.005)

Effects de MZ on HNE-protein binding affinity in vitro. Los hallazgos de inmunoblotting (punto-blot) del conjugado HNE-BSA formado in vitro por la presencia de MZ se presentan en la figura 2. Lainfinidad de HNE para formar conjugados con proteínas, como se evalúa en este experimento usando BSA, se incrementó 30-40% si el HNEse mezcló conBSA en presencia de MZ.que era más obvio cuando la proteína/aldehyde/ Solución de zeolita fuedilutó diez- pliegue antes de aplicar a la membrana de nitrocelulosa(muestras 5 y 6 frente a la muestra 7 y 8, es decir, medio dots)

Nuestros experimentos in vitro anteriores (10) mostraron inhibición de la proliferación de varias líneas celulares después de la incubación con MZ (0,5-50 mg/ml) Mediopretratado.Now que addedMZdirectamente al medio cultural,yla proliferación celular fuetambién inhibióincluso conconcentración mucho menorutilizado.el mejorylos resultados más consistentes se obtuvieron conHeLa y MiaPaCa-2líneas celulares. However, la célula Hep-2 line parecía ser resistente al efectoinhibitorio de MZ (al menos para lasconcentraciones de la zeolita utilizada).Ascording aestos experimentos, nuestra conclusión es que la respuesta de MZ fue celular line-dependiente.previamente analizamos los efectos de MZin vitro enmitogénicos y survival-señalización de vías en las células tumorales(10) los resultados más significativos se observaron en la activity de la proteína Akt que fue fuertemente inhibida despuésdel tratamiento mZ de las células cancerosas.que dio lugar a un crecimiento enhibición y enpliegue enapoptosis de células cancerosas,pero sólo en presencia de scrum.absorción de componentes séricos al menos in vitrocser uno de los mecanismos de MZacción.enfavor de este unsunsiónsonresultados de un aumento de la HNE-proteínaconjugadoformación en presencia de MZ. HNE tiene una alta afinidad de binding a proteins.por lo que, puedeenlazaralbúmina sérica.quepuede así atenuarsu toxicidad.sin embargo, vinculante para proteins,comoBSA,estabiliza altamente reactivoHNEQue couldtodavía lograrsucyatóxicoefectos. Supongamosque los efectos citotóxicos de MZ podrían ser modificados por su interferencia física o biológica con la peroxidación lipídica y, en particular, HNE, MZpodría actuar como un carroñero HNE pero la unión de HNE a MZ también podría afectar a la actividad de MZ, en particular en presencia de proteínas que podrían unirse a ambas sustancias, así como a las células. Esto también podría ser relevante para los efectosin vivo de MZ, en particular en condiciones de estrés oxidativosistémico, como la quimioterapia del cáncer.

Since por vía oral-administrado MZ no se absorbe enla sangre su afectas in vivo no puede ser debido a interacciones bioquímicas directas.especulamos que MZmay inducirciertosinmunológicorespuestas oestrés generalrespuesta activadapor el sistema gastrointestinal,en particular teniendo en cuenta el intestino como un órgano de estrés. Si es así, MZ también debe influir enlos procesosinflamatorios, así como el estrés sistémico.

Elencercero C y la inflamación se pueden considerar como interferencias processes que comparten dos mecanismofisiopatofia común red de citoquinas y estrés oxidativo. Ambos procesos implican peroxidación lipídica y están vinculados por estroma tumoral. TNF-a y TGF-B se encuentran entre las citoquinas que estána la intención de sermediadores de este complejo sistema de redes, que interfieren con laeroxidaciónde los lípidos y, en consecuencia, con la biológica efectos de HNE(conocidocomo un segundo mensajero de los radicales libres)On porotrolado, HNE también puede actuar un factor deregulación bifuncional crecido (citotóxico o estimulante del crecimiento) interfieren con la actividad de los factores cultivados en suero. Los efectos moduladores cultivados de HNE implican víade señalización que afecta a la expresión de c-fos y pueden interferir con la actividad de EGF y PDGF. HNE como segundo mensajero de ROS activa AP-1 seguido de mássíntesis de TGF-B en fibrogenesis (propagacióndela tejido) Además, lipo de bajadensidadoproteína modificada porlipid peroxidation (oxLDL)es conocido como un potente inmunogénico citotóxicoypro-factor inflamatorio que activaproducciónde citoquinaspor células estromales(fibroblastos endotelio y macrófagos)esto conduce a un mayor estrés oxidativo y la propagación de la inflamación asociada con más li pidperoxidación(resultando en la producción de HNE) cuyos efectos podrían demostrarse in vivo tan pronto como media hora después de la administración. por lo tanto,queasumir que la aplicación de MZ en el aguapor gástricointubación podría,en un período relativamente corto de tiempo(una hora como lo hacene en el experimento presentado)respons provocaronedeel sistema gastrointestinal,que podría inducir aún más una respuesta sistémica.Regarding la especificidad de la MZefecto antioxidante sobre las células estromalesenDoxorubicina-tratado W256carcinomas, suponemos querespuestas diferenciales decélulas malignas y normalesaelefectos antioxidantes deMZpodríadebe ser debido a:1)diferente patrón de metabolismo del oxígeno entre estas células(estrés oxidativointerno):2) la diferencia en su respuesta a las citoquinas implicadas en la determinación del tumor-relaciónde huésped,3) aplicación dela respuesta ic del sistemaMZ y estrés oxidativo inducido por doxorubicina.

Las células tumorales tienen una composición lipídica anormal y un nivel de enzimas del sistema citocromo P-450 que pueden iniciar y propagar la peroxidación lipídica y, por lo tanto, pueden causar alteraciones enel nivel H NEy MDA. en nuestro estudio anterior la peroxidación lipídica se redujo en animales quealimentado undieta complementada con MZ.de acuerdo conGonzález,niveles de oxir las enzimas de barrido adical se reducen en las células tumorales.Por lo tanto,un nivel reducido de peroxidación lipídica en MZ-tumor tratado-ratones portadores podrían ser el resultado de laMZpotencial antioxidante.Aaumentó significativamenteSODcontenido en el hígado de ratonesfed durante 3 semanas conMZcomplementado a la normaalimentos también confle bizaron estos datos.

Nuestros resultados anteriores han demostrado que algunos efectos antitumorales y antioxidantes de MZ in vivo antimetastásicos están asociados con sus efectos de inmunomodulación en particular relacionados con la actividad de los macrófagos fagocitosis de micropartículasMZ. Se sabe que la fagocitosis y/o ROSpuede estimular los macrófagospara secretar TNF-a y otras citoquinas quenormalmente estimularinmunológicorespuesta. TNF-a también mejora la expresión de SOD. En nuestro experimento, el contenido de SOD en el hígado de ratones alimentados con MZ pudo aumentar. En nuestro estudio actual encontramos que MZ podría tener un efecto antioxidante sobre lascélulasomal, pero no enlas célulastumorales, y la doxorubicina- trcomido carcinoma W256. Estos datos confirman que las células malignas y normales resestanque de manera diferente a los efectos antioxidantes de MZ, lo que significa que MZ podría tener efectos antioxidantes y antitumorales al mismo tiempo tiempo, que se confirmó aún más con los hallazgos del aumento de los efectos antimetastásicos de la doxorubicina en el carcinoma mamario (modelo de metástasis pulmonar artificial) si los animales también eran tratados con MZ. Por lo tanto, MZ podría ser utilizado como un nutracéutico (suplemento alimenticio) durante la quimioterapia del cáncer.

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